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开题报告 2006年12月29日 利用mRNA原位杂交技术研究红肉脐橙果实成熟过程中类胡萝卜素生物合成相关基因的表达 研究生: 文奇根 导 师: 徐娟 课题的提出 课题的提出 红肉脐橙果实中积累番茄红素的机制尚未得到很好的阐述 柑橘果实成熟过程中，类胡萝卜素生物合成相关基因的时空表达研究较少 研究目的 利用mRNA原位杂交技术研究红肉脐橙和华盛顿脐橙的另一芽变品种清家脐橙中与果实类胡萝卜素生物合成途径中相关的基因时空表达差异，并以此探讨红肉突变的机理 ，为解释红肉脐橙果实中积累番茄红素的机制提供理论依据。 研究目的 对红肉脐橙果实中编码番茄红素β环化酶的基因可能存在的两个或多个拷贝进行分析，并对不同拷贝在果实中特异表达的规律进行探讨 前人研究进展 类胡萝卜素生物合成相关基因的调控主要包括转录和转录后调控两种机制 牦牛儿牦牛儿焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、番茄红素β环化酶、β胡萝卜素羟化酶是类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶，在番茄果实中，这些酶至少由两个基因编码 (Galpaz et al., 2006） 前人研究进展 Fanciullino等对25个不同基因型柑橘果肉中不同类胡萝卜素组成和含量进行HPLC分析,结果表明柑橘中积累的类胡萝卜素成分与柑橘的基因型相关，并根据果肉中的类胡萝卜素组成和含量差异进行聚类分析，分析表明柑橘种间果肉中类胡萝卜素差异大于种内差异。 (Fanciullino, A. L. ,2006) 前人研究进展 Kato等以温州蜜柑、伏令夏橙、里斯本来檬为材料研究类胡萝卜素积累与类胡萝卜素生物合成相关基因表达的关系时发现，在柑橘果皮由绿转橙过程中，带ε环的类胡萝卜素（α-胡萝卜素、叶黄素）的积累向带β环的类胡萝卜素（β-胡萝卜素, β-隐黄素, 玉米黄素, 紫黄质）积累过渡 前人研究进展 果皮中类胡萝卜素的组成与果肉中的存在差异，这种差异与类胡萝卜素生物合成相关基因的表达相关，这种差异表明果皮和果肉中可能存在不同的类胡萝卜素生物合成途径 陶能国等以红肉脐橙为材料发现，编码番茄红素ε环化酶的基因在果实成熟过程中发生了选择性剪切 前人研究进展 RNA原位杂交技术能够有效的进行基因时空表达，Christensen 等成功的将RNA原位杂交与免疫组织化学技术结合进行了橙类果实中果胶甲酯酶的定位研究，并分别探讨了橙类果皮和果肉中编码果胶甲酯酶基因的特异表达部位。 (Christensen et al., 1998) 研究方案-实验材料选择 以红肉脐橙和清家脐橙为材料 材料取自宜昌市太平溪镇 材料处理： 从同一单株收集2006年8月至11月果实，分黄皮层、白皮层、囊衣汁胞进行分割，用于原位杂交的样品立即用FAA固定液固定，用于RNA提取的材料用液氮冷冻后于-70oC超低温保存 研究方案-研究指标的选择 不同采样时期果皮、果肉色泽测定 果实中八氢番茄红素合成酶、番茄红 素β环化酶、β胡萝卜素羟化酶的mRNA时空表达水平的测定 编码番茄红素β环化酶基因的不同拷贝测定及特异性表达分析 实验方法-药品及试剂 RT-PCR利用试剂盒提供方法进行 PCR引物由公司合成，其他试剂均用分子生物学专用试剂 mRNA原位杂交参照Janice de Almeida Engler（2001）报道的方法进行 实验方法-药品及试剂 原位杂交常用试剂： Tris-HCl (pH7.0、8.0) 蛋白酶K（1ug/ml）：消化蛋白质 甘氨酸：中止蛋白酶反应 0.2N HCl:去蛋白质 BSA：牛血清白蛋白 实验方法-仪器 实验方法-果实生理指标测定 分别取不同时期采取的果实进行以下生理指标测定 利用L*a*b*系统进行果皮和果肉色差测定 糖（可溶性固形物）、酸及维生素C的测定 类胡萝卜素成分和含量的测定 实验方法-分子生物学实验 RNA利用Trizol法和LiCl沉淀法提取 利用陶能国设计的编码八氢番茄红素合成酶、番茄红素β环化酶、β胡萝卜素羟化酶的基因为探针进行mRNA原位杂交 结合PCR-AFLP法对编码番茄红素β环化酶的基因不同拷贝数进行分析 可行性分析 华中农业大学作物遗传改良国家重点 实验室能够满足实验所需要的条件。 实验室已经成功构建红肉脐橙果肉cDNA文库，并对红肉脐橙和华盛顿脐橙果实不同发育时期类胡萝卜素成分和含量进行了HPLC分析 在上述成果的基础上开展本研究可以达到预期的结果 经费预算 差旅费：1500元 仪器使用费：2000元 药品费： 9000元 其他： 7000元 合计： 19