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* * WINTER Template 食源性致病菌 的快速检测 01 02 1.免疫学检测技术 2.核酸探针技术 3.聚合酶链反应(PCR)等技术 4.生物芯片技术 5.生物传感器检测技术 6.其它技术 03 微生物快速检测方法特点1快速,一般在几小时至24小时内； ??2灵敏度高、特异性高； ??3操作和使用比较简单 04 基础：抗原和抗体的特异性结合 是最特异、最灵敏、用途最广泛的技术之一。 主要方法：1.凝集反应2.沉淀反应3.酶联免疫吸附测定法（ELISA）4.单克隆抗体 免疫学检测技术 05 ELISA 技术中对于沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、李斯特菌等血清型细菌有很好的检测效果。 常用的ELISA方法的检测时间包括加样、保温、洗 涤、加抗体等时间。操作时间长， 步骤烦琐。2002年美国生产的自动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)t51。该系统根据ELISA 的基本原理，采用“夹心技术”，检测蓝光与抗原成正比，可以在45min至2h内完成全部检测工作。 WINTER Template 1.PCR：polymerase chain reaction 2.Southern杂交 3.Northern杂交 4.LCR：ligase chain reaction 5.PCR-ELISA检测 06 核算分子检测技术 07 PCR：在体外通过酶促反应进行一段特定DNA或RNA片段扩增的技术为获取目的DNA片段的一项常规技术 1.变性（denaturation）： 加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单 链DNA。  2.退火（annealling）： 温度降低时使引物和其互补的模板在局部形成杂交链。  3.延伸（extension）： 在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸及Mg2＋存在的条件下，催DNA链延伸反应。PCR-聚合酶链式反应体系∣ 模板DNA 或RNA∣一对寡核苷酸引物∣ 4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)∣ 热稳定的聚合酶(Taq)；∣ Mg+缓冲液。 08 荧光PCR (Real Time PCR) PCR + 荧光标记 + 监测系统 Non-specific DNA binding dyes SYBR? Green I Ethidium Bromide Specific Hybridization Probes TaqManTM molecular beacons dual-oligo FRET pairs 09 主要步骤: DNA(RNA)提取和纯化; 凝胶电泳; 印迹转移; 探针和杂交显色 Southern /Northern blotting技术 Western blotting 蛋白质的提取和纯化; SDS-聚丙酰胺凝胶电泳; 印迹转移; 抗体和杂交显色 10 最早用于缺少基因片断的检测;用于多基因的同时检测或进行细菌的属, 种,型以及特异性基因段的同时检测; 应用： 沙门氏, 志贺氏; 霍乱弧菌; 副溶血性弧菌, 病原性大肠埃希菌(出血性大肠杆菌O157：H7，致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌)，变形杆菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌; 空肠弯曲菌; 厌氧菌(空弯, 产气荚膜梭菌, 肉毒梭菌); 多重PCR WINTER Template 11 生物芯片技术 Biochip 该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和Northern Blotting等）技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等不足。 原理：采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。 12 生物传感器Biosensor 生物感应器， 既可以辨认一个分子的信号，也可以辨认大分子量的信号。整个细胞都可以用作生物感应器。在应用微生物领域游乐广阔的发展前景，检测对象包括毒素(葡萄球菌肠毒素、海豚毒素、贝类毒素等)、特定的致病菌(例如沙门氏菌、葡萄球菌、大肠杆菌OIs，：H，等)。 常用于糖尿病人的血糖监测、空气传播细菌的遥测、食品分析中的应用包括食品成分、食品添加剂、有害毒物及食品鲜度等的测定分析。