流式细胞仪析技术及应用.doc

流式细胞仪分析技术及应用 流式细胞术主要包括： 1、液流技术 2、细胞的分选和计数技术 3、数据的采集和分析技术 流式细胞术发展史 主要特点 ： 单个细胞水平分析； 多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析； 高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度； 可分析大量细胞； 速度快： 5000-10000个细胞/秒； 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况； 分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。 流式细胞仪分为三大类： 一类为台式机（临床型）： BD FACSCalibur流式细胞仪特点： 仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。 两激光配置：488nm 633nm 检测参数：四荧光参数 两个散射光参数 分析型流式细胞仪 应用：细胞分析检测 FCM图片——台式机 第二类为大型机（科研型） 特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。 FCM图片——大型机 第三类为新型流式细胞仪： 随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4 根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15 个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。 BDFACSAria流式细胞仪： 高速分析分选流式细胞仪 高速分析 高速分选 3根激光： 488nm 633nm 375nm结合特制高性能石英杯流动室 应用：细胞分析分选 sp细胞检测 一般分为5 部分： ① 流动室及液流驱动系统； ② 激光光源及光束成形系统； ③ 光学系统； ④ 信号检测、存贮、显示、分析系统； ⑤ 细胞分选系统。 流式细胞仪构造模式图 光学测量台→电子控制台→数据采集、储存和计算机处理。 光学测量台：完成光学信号测量和转换 电子控制台：将转换的电脉冲信号进行整形、放大并模数转换成数据信号→数字信号→最后送入电子计算机里储存处理→ 输出直方图、二维点图、等高图、三维图以及其他统计结果。 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 流动室与液流驱动系统 细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli 方程： P=(1/2)PV （勿略高度的变化） 真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一个恒定的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。 改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。 激光光源：采用气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管（PMT）：FSC, SSC（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） 流式细胞仪构造模式图 激光光源与光束成形系统 大多采用氩离子气体激光器： 激光（Laser）是一种相干光源，提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1 微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm 即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图1-2-6）。 这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。 激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。 激光光源及光束成形系统 主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3 类： 1、长通滤片：（long-pass filter, LP） ：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或