利用宏基因组技术筛选脂肪酶基因方法的研究与分析.doc

利用宏基因组技术筛选脂肪酶基因方法的研究与分析 一. 提取总DNA。这一步可得到四组DNA，然后分别进行以后的实验。 1.提取土壤总DNA. 我们先采集土壤样品，将其分A1,A2,A3,B1,B2,B3两组，A组直接提DNA，在B组土壤中加适量橄榄油、植物油及各种营养成分，搅拌后37℃培养一周后提DNA。以达到富集和扩大基因总量的目的。这两组分别进行一下两步实验。 运用改良的方法：取5 g过筛研磨过的土样，加入15 mL洗涤液洗涤土样，9 000 r/min离心10 min，去上清，反复洗涤3次;加入11．5 mL提取液和250μL溶菌酶，37℃下225 r/min水浴30 min;加入50μL蛋白酶K，37℃下225 r/min水浴30 min;加入1．5 mLSDS，65℃下225 r/min水浴2 h;4 000 r/min离心10 min;取上清，加入等体积氯仿，异戊醇抽提 (9 000 r/min离心10 min)3次;取上清，加入1 /1预冷无水乙醇，－20℃沉淀30 min;9 000 r/min离心10 min，加入1 mL蒸馏水溶解沉淀，4℃保存． 2.提取污水总DNA. 同样，我们先采集污水及少量污泥样品，将其分为C1，C2，C3, D1，D2, D3两组，C组直接提DNA，在D组中倒入橄榄油、植物油及各种营养成分并培养。这两组分别进行一下两步实验。本实验用低熔点琼脂糖包埋法提取水样的宏基因组大片段DNA，得到的片段长度在48Kb以上。由于单一包埋块中基因组DNA含量较低，因此多个琼脂糖包埋块一起用酶法纯化后浓缩以达到提高基因组DNA的浓度。为了满足建库要求，以后用吹打法对其进行了小片段化。 样品基因组DNA的提取在CTAB-NaCl基础上稍作修改。 （1）取样品1ml于1.5ml离心管，12，000rpm离心5min弃上清，重复该操作3次； （2）加入567μlTE，用吸管反复吹打使菌体重悬； （3）加30μl10%SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K，用旋涡振荡仪混匀，37℃温浴60min； （4）加100μl 5mol/L NaCl充分混匀，再加入80μl的5%CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃温浴30min； （5）加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀。4℃于12，000rpm离心5min，上清液转移至另一离心管中； （6）重复（5）中氯仿/异戊醇抽提，直到看不见界面为止，以除去多糖和其他大分子； （7）上清液转移至另一新的离心管中，加入0.6倍体积的异戊醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，-20℃放置30min。取出后4℃下12，000rpm离心2min，弃上清； （8）用500μL乙醇清洗沉淀，4℃下12，000rpm离心2min，弃上清； （9）加入100μLTE溶解DNA。 （10）NaAC无水乙醇沉淀DNA。 二． DNA 纯化 采用胶回收的方法纯化通过间接提取法提取的 DNA。 DNA在 1.5%琼脂糖凝胶以 10 V/cm 电压电泳分离 3 小时，用胶回收纯化。 三． DNA 宏基因组文库的构建 1． DNA 酶切时间优化 用 BamH I 酶切，每隔 30 分钟从酶切体系中吸取 2 ul，与 1 ul 10×Loading buffer 混匀。在 1%琼脂糖凝胶以 9 V/cm 的电压电泳分离 40 分钟，监测 6 小时以内的酶切产物变化。确定酶切片段集中在 6～9 Kb 的最佳酶切时间。 2 DNA 酶切产物纯化回收 在 1%琼脂糖凝胶以 9 V/cm 的电压电泳分离 1 小时，用 OMEGA 胶 回收试剂盒回收 2～9 Kb 的 DNA 片段。 3.利用改进的碱裂解法提取质粒（购买含质粒的大肠杆菌） 1. 从 LB 平板上挑取单克隆菌体，接种于 LB 液体培养基（含 100 μg/ml 氨苄青霉素）中，37 ℃，200 rpm，振荡培养过夜； 2. 10000 rpm，离心 1 分钟，弃上清液； 3. 用 1 ml STE 重悬菌体，振荡混匀，10000 rpm 离心 1 分钟，弃上清； 4. 加入 100 μl 预冷的溶液 I 重悬菌体，冰浴 2 分钟； 5. 加入 200 μl 新配置的溶液 II，盖紧管口，轻轻颠倒离心管 2 次，充分 混匀，冰浴 3 分钟； 6. 加入 150 μl 溶液 III，盖紧管口，轻轻颠倒离心管 5 次，冰浴 5 分钟； 7. 10000 rpm 离心 10 分钟，弃沉淀，将上清液转移至新的 EP 管中； 8. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，4 ℃，12000 rpm 离心 10 分钟， 上清液移至新的离心管中； 9. 加入等体积的氯仿混匀，4 ℃，12000 rpm 离心 10 分钟，上清液移至新 的 EP 管中