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（三）Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株(一种嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性。（天然酶）另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶）Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。 (一)酶活性与热稳定性 1）酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000∪/mg，Taq酶的浓度通常为1~2.5∪/?l，太多浪费并易导致非特异性扩增。 2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。 (二)离子依赖性 1）Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对Mg2+ 浓度非常敏感。 2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。 3）Mg2+ 能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+ 浓度，优化浓度一般反应 中Mg2+ 浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0 mmol/L。 4）适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%。 Taq DNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能的。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%～0.25%。Taq DNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Vent和Pfu DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但对4种dNTP聚合到3′-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A。我们利用它的这种特性，在构建T载体时，在反应体系 中只加一种底物，即只加dTTP。此酶就催化在载体末端加上dT,这种载体即可直接用来克隆PCR 产物。 4.耐热DNA聚合酶：2.5~5 u 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。 （1）TaqDNA聚合酶Taq DNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55℃时为22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。 Taq DNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能的。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%～0.25%。Taq DNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Vent和Pfu DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但对4种dNTP聚合到3′-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A。我们利用它的这种特性，在构建T载体时，在反应体系 中只加一种底物，即只加dTTP。此酶就催化在载体末端加上dT,这种载体即可直接用来克隆PCR 产物。 （2）Tth DNA聚合酶 在95 0C半衰期为20分钟，具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。但不具3??5?外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为1/500 （3）Vent DNA聚合酶 该酶在1000C时半衰期达95分钟，97.50C时半衰期长达130分钟，其扩增产物的长度可达10~13kb。Vent DNA聚合酶具有3??5?外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000，忠实性比TaqDNA聚合酶提高5?10倍。 （4）Pfu DNA聚合酶 此酶耐热性极好，在97.50C半衰期大于3小时，具有3??5?外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高12倍。 * *