(生化工程课件）16 沉淀法.ppt

16 沉淀法 知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂 沉淀法，非离子型聚合物沉淀法,聚电解质沉淀法, 金属离子沉淀法。 重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。 难点：常用沉淀方法的灵活运用。 根据沉淀剂的不同 盐析法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 高价金属离子沉淀法 1．盐析法 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 　　2．有机溶剂沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 　　3．等电点沉淀法 用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 　　4．非离子多聚体沉淀法 用于分离生物大分子。 　　5．生成盐复合物沉淀 用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 　　6．热变性及酸碱变性沉淀法 用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 16.1 盐析法 定义 - 向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐,以破坏蛋白质胶体性质，使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的现象 16.1.1 Cohn 方程式 离子强度对盐析过程的影响 Cohn经验公式 S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价 M为盐的摩尔浓度 β和Ks的物理意义 β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值，与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。 用盐析分离蛋白质方法 （1） Ks盐析：固定pH, 温度，改 变盐浓度 （2） β盐析：固定离子强度，改 变pH 及温度。 16.1.2 pH和温度的影响 16.1.3 (NH4)2SO4 盐析法实际应用时的注意点 先除去杂蛋白，然后在较高的饱和度下，沉淀目标蛋白，操作步骤如下 16．1.4　起始浓度的影响 16.1.5 盐析的机理 16.4 蛋白质盐析 机理： （1）破坏水化膜， （2）中和电荷 盐析经验式 盐溶 盐析 饱和度 中性盐的盐析效果 蛋白质胶体溶液的稳定性 两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： 无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀； 　16.2 等电点沉淀 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。 概念： 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 （1）适用于疏水性强的蛋白 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏 酸方向移动，溶解度增大 （4）价廉价，无毒 （5）蛋白对低pH 敏感，易失活 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 （2）溶质的稳定性 （3）盐析效应 16.3 有机溶剂沉淀法 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。 常用的有机溶剂沉析剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 特点： 介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22 容易获取 有机溶剂沉淀法的优点 溶剂易挥发，适于制备食品蛋白； 溶剂密度低，便于离心分离； 有机溶剂沉淀法的优点 易使蛋白质变性 易燃易爆，安全要求高 溶剂选择 介电常数要小 致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中 水溶性要好 有机溶剂沉淀时，应注意点 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）； 溶剂的选择：和水互溶，与蛋白质不