05第六章 酶、细胞、原生质体固定化.ppt

第六章 酶、细胞、原生质体固定化 直接应用酶的不足之处 酶的稳定性差 一次性使用 分离纯化较困难 固定化酶的优点 酶的稳定性明显改善； 酶的利用效率高； 易于分离纯化； 反应条件易于控制； 适合于多酶催化反应。 第一节 酶固定化 固定化酶制备原则 （1）维持酶的催化活性及专一性； （2）有利于生产自动化、连续化； （3）应有最小的空间位阻； （4）酶与载体必须结合牢固； （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应液发生化学反应； （6）成本要低。 酶的固定化方法（一） 酶固定化方法示意图 1、吸附法(link) 2、包埋法(link) 3、结合法(link) 4、交联法(link) 5、热处理法(link) 1、吸附法 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶。 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落. 2、包埋法 包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。 多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等 2、包埋法 ①聚丙烯酰胺凝胶包埋法。 一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N’—甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml 15％的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1％过硫酸钾(引发剂)，混合，于25℃：保温10min，便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒．于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。 聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。聚丙烯酰胺凝胶包埋法： AP Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED 海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至 海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中 IE (or IC) 卡拉胶包埋法： 卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜: Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将酶在37-50℃溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40-60 ℃溶于生理盐水中，二者混合后，趁热滴在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。 (2)半透膜包埋法 半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小 适用性底物和产物都是小分子物质的酶 3、结合法 选择适宜的载体,通过载体的共价键或离子键(非共价健)与酶结合在一起的固定化方法 3、结合法 重氮法 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团 叠氮法 含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物 溴化氰法 含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物 烷基化法 含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体 4、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构 特点：此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体 双功能试剂：戊二醛、己二胺、双偶氮苯等 5、热处理法 在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内 适用性热稳定性较好的酶的固定化 严格控制加热及其时间 固定化方法的比较 吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。 共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。 交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。 包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。 二、固定化酶的特性 1、稳定性(link) 2、最适温度(link) 3、最适pH(link) 4、底物特异性(link) 1、稳定性 相对游离酶的优点 （1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度 1、稳定性 （2）保存稳定性好，保存时间延长 （3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解 （4）对变性剂(如