植物细胞培养42910.ppt

第四章 植物细胞培养 本章主要内容 ? 单细胞的分离与培养 ? 悬浮细胞培养 ? 植物细胞培养的应用 第一节、单细胞的分离与培养 一、分离单细胞的方法1、物理方法2、化学方法3、酶法 1、物理方法将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩气体，细胞分散的更好 。 2、化学方法是在细胞悬浮培养中加入草酸盐（能结合细胞间质中果胶钙的钙离子 ）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（对细胞分散有一定的作用）。 3、酶法利用果胶酶和纤维素酶使细胞分离。 二、单细胞的培养方法 ? 平板培养 ? 看护培养 ? 液体浅层培养 ? 微室培养（微滴培养） 1、平板培养 ?技术要点：单细胞悬浮液的制备：先过滤细胞悬浮液，去掉全部组织块和大的细胞团，获得含单细胞或4-6个的细胞团的悬浮液调节细胞密度；固体培养基的制备；接种细胞：把单细胞悬浮液转移到琼脂平板上，铺成大约1mm的薄层，然后观察细胞植板率。 ?植板率：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。 2、看护培养 1953年Muir创立； 定义：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法； 具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织上培养。 3、液体浅层培养 技术：先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。 ?优点：?、培养物与空气接触面大，通气性好；、细胞代谢产物容易扩散，不会造成有害物质的危害；、继代培养方便、便于观察。 ?缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察 5 、悬浮细胞培养：将细胞接种于液体培养基中培养。（单独讲解） 第二节、悬浮细胞培养 ? 悬浮培养(suspension culture):是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 二、悬浮培养的优点： ? 一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善 营养供应； ? 二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； ? 三是振荡培养可以适当改善气体的交换； 三、悬浮培养过程中细胞生长情况分析测定方法： 1、细胞计数：单位体积细胞浓度； 2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积； 3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重 四、悬浮细胞培养的同步化方法 1、体积选择法：将培养细胞经过一定大小的筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集。 2、冷处理法：先收集细胞，后在低温（一般为4度）下处理一定时间后加培养液培养。 1、饥饿法：控制营养使细胞处于饥饿状态，后加营养培养； 2、有丝分裂抑制法：向培养液中加入化学抑制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、秋水仙素 五、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： ?悬浮培养物分散性良好，细胞团较小； ?均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同； ?细胞生长迅速（2～3天加倍）。 六、悬浮细胞培养方法 ?分批培养法：● 是一种封闭的培养体系，培养过程中不放出培养液，也不补加培养液；● 培养方法：旋转培养；往返培养；旋转振动；搅动培养；在培养过程中，每隔一定时间更换一部分培养液或添加某种营养成分。 七、影响悬浮细胞生长的因素：起始愈伤组织的质量；接种细胞密度；培养条件：方式、温度；继代周期。 八、细胞的保存 ?继代培养保存法： 细胞定期继代培养，常用； ?低温保存法： 5－10度温度下培养并定期更换培养液； ?冰冻保存法： 分为低温保存（－20度）和超低温保存（液氮保存） 第三节、植物细胞培养的应用植物细胞含有人类所需的成分，包括初生代谢物（蛋白质、碳水化合物、脂肪等）和次生代谢物（多酚类、香精油、生物碱、树脂等），传统提取分离这些物质由于资源短缺和需求量的加大，难以满足需求，通过细胞培养生产植物产品成为解决的有效途径。 （一）、细胞培养的主产品 1、药用代谢产物生物碱（吡啶、喹啉）、蛋白质类（氨基酸、植物抗生素、）、酚类化合物（黄酮类、单酚类、醌类）、萜类化合物（三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、二萜）等。 2、天然食品、食品添加剂色素（胡萝卜素、叶黄素、单宁）、甜味剂（甜菊苷）、香料物质、饮料（可可碱、咖啡碱）等； 3、杀虫剂、杀菌剂万寿菊细胞中获得农药噻吩烷；鹰嘴豆细胞中得到除虫菊脂；香草细胞中分离到鱼藤酮杀虫剂等； 4、饲料、精细化工产品 （二）、细胞培养技术的优点 1、培养细胞是在无菌条件下生长的,不受地区、季节和气候限制； 2、占地面积少； 3、天然产物的生产在控制的条件下进行,可以得到超越整体植物产量的代谢产物； 4、能够产生原植物所没有的，甚至是至今在自然界还没有的化合物。 （三）、植物细胞生物反应器 生物反应器的特点：在可控制条