第2章 基因工程 下(西南大学 普通生物学).ppt

NPT-Ⅱ抗Kan （2）载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选　　 抗草甘膦 　　具完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-半乳糖苷酶(Z)、透性酶(Y)和乙酰基转移酶(A)。当培养基中含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) 时，可产生蓝色沉淀物，使菌落成蓝色。 　　 （3） 乳糖操纵子lac Z基因筛选 　　含乳糖操纵子缺陷型(lac Z)的载体转化互补型菌株，在含X-gal和IPTG的培养基中培养，克隆子是蓝色菌落，而未转化的互补型菌株的菌落是白色的。当含目的基因的DNA片段插入lac Z基因区，即使转化互补型菌株细胞，在含X-gal和IPTG的培养基中，也是长出白色的菌落。根据菌落的蓝、白颜色筛选出含目的基因的克隆子。 　　 （5）核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选 （4）生长调节剂非依赖型筛选 　　如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞不能编码的，可通过检测酶活性的存在与否来筛选目的基因。 2）通过酶活性筛选 　　先将目的基因（目的基因的突变）定位到染色体上，并在目的基因的两侧确定一对紧密连锁的分子标记； 6、图位克隆目的基因 基因图位克隆(map-based cloning) 　　接着利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移将位于这两个分子标记之间含目的基因的特定基因组片段克隆并分离出来； 　　最后根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目的基因。 第四节 重组DNA导入受体细胞 一、 受体细胞 能摄取外源DNA(基因)，并使其稳定维持的细胞 受体细胞 　　容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，用作cDNA文库和基因组文库的受体菌。 1、原核生物细胞 大肠杆菌 蓝藻 农杆菌 酵母 2、真核生物细胞 　　一个活的离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株，获得外源基因的体细胞可以培养成能传代的植株，成为转基因植物。 植物细胞 　　常采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞。体细胞可表达基因产物，并且通过体细胞培养出了多种克隆动物。 动物细胞 体细胞不易再分化成个体， 指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞 　　 二、重组DNA导入受体细胞的途径 1、重组DNA分子导入原核生物细胞 感受态细胞 　　携带目的基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程。 （1） 转化（transformation） 质粒为载体 （2） 转导（transduction） 　　通过噬菌体(病毒)颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程。 　　含目的基因的DNA与噬菌体（病毒）载体的重组DNA分子导入受体细胞，必须进行体外包装。 　　裸露的DNA片段直接转化感受态受体细胞。细菌细胞必须对DNA有通透性。 （3）转染（transfection） 　　将被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌、含广泛宿主辅助质粒的辅菌三者进行共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体菌细胞内。 （4） 三亲本杂交（triparental mating） 　　由于真核生物的细胞结构较为复杂，适用于原核生物基因转移的方法不能有效地用于真核生物。 2、重组DNA分子导入真核生物细胞 （1）重组DNA分子导入植物细胞 　　Ti质粒载体与含目的基因的DNA片段重组，导入根癌农杆菌，再采用叶盘转化法、原生质体共培养法和悬浮细胞共培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。 1）根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化 　　将植物材料的叶片进行表面灭菌，用无菌的打孔器从叶片上取下圆形小片，接种含Ti质粒载体重组DNA的致癌农杆菌。由圆形小片长出的愈伤组织通过筛选培养和再分化培养就可以获得转基因植株。叶盘转化 　　取含Ti质粒载体重组DNA的致癌农杆菌，同刚再生细胞壁的植物原生质体进行短暂的共培养，使重组DNA导入细胞，经筛选和再分化培养获得转基因植株。 原生质体共培养转化 　　此方法类似原生质体共培养转化法，不同的是首先建立植物悬浮细胞系。 悬浮细胞共培养转化 根癌农杆菌介导法一般用于双子叶植物。 　　将含目的基因的外源DNA同金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。 　　金属微粒在外力作用，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，植物细胞仍能维持正常的生命活动。 2）微弹轰击（ bombardment） 基因枪（gene gun）法 　　将重组DNA涂于授粉的柱头上，或微量注射器将DNA注入子房，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠的卵、合子和心进人胚囊，转化尚不具有正常细胞壁早期的胚胎细胞，在活体内产生转基因种子。 3）花粉管通道