李红叶性状RAPD标记及CHS基因cDNA克隆.docx

摘 要 查尔酮合酶(Chalcone Synthase，CHS)是类黄酮合成途径中的一个关键酶。 CHS 表达量的增加或减少都可能导致植物叶色的变异。本研究利用 RAPD 技术， 筛选出与李属(Prunus)植物红叶性状相连锁的分子标记；并采用同源克隆的方法， 克隆 5 种李属植物查尔酮合酶基因的 cDNA 序列。主要研究结果如下： 1. 以红叶李(P. salicina × P. atropurupurea)和安哥诺李(Prunus salicina cv. ‘angenuo’)为杂交组合，正反交后得到 56 株 F1 代杂交苗。结合分离群体分组分析 法(Bulked Segregate Analysis, BSA)，依据 F1 代杂交苗叶片颜色划分出“红叶”和 “绿叶”两个分离群体，构建“红叶”和“绿叶”两个近等基因池。应用 RAPD 标记技术，用随机引物对两个基因池、父母本及其余 F1 代个体 DNA 进行 PCR 扩 增，筛选与李属植物叶片红色性状相连锁的分子标记。研究结果显示，通过对 350 个随机引物的筛选，获得一个在红叶基因池中能稳定扩增而在绿叶基因池中不出 现的 RAPD 标记，该扩增条带大小约为 2 300 bp，命名为 S450-2 300。经过重复 性验证和 F1 代群体单株验证，该标记片段仅在红叶个体(重组型除去)中出现，表 明与李属植物叶片红色性状相连锁，连锁距离为 11.2 cM。 2. 以红叶李、安哥诺李、黑杆樱李(Prunus wrasifers ‘Nigra’)、美人梅(Prunus × bliriana ‘Meirenmei’)和紫叶李(Prunus cerasifera var. atropurpurea)为试材，采集 不同时期的叶片，用试剂盒法提取总 RNA。以 Oligo(dT)为引物，在反转录酶作 用下合成 cDNA 第一链，并用设计的特异引物 CHS-F 和 CHS-R 进行 PCR 扩增。 琼脂糖凝胶电泳检测显示，5 种李属植物各扩增出一条大约 1 200 bp 的条带，与 预期的条带大小一致。用试剂盒将目的基因片段回收后与载体 pGEM-T 连接，转 化大肠杆菌感受态细胞 DH5α。用上述特异引物对单菌落进行 PCR 扩增，结果表 明多数为阳性克隆菌落。将检测为阳性克隆的菌落送测序公司测序，测序结果显 示，所得到的 5 种李属植物的 CHS 基因 cDNA 序列长度为 1 170 bp~1 176 bp，推 测的氨基酸序列长度为 389~391 个氨基酸。CHS 基因 cDNA 序列同源性分析表明， 5 种李属植物的 CHS 基因之间同源性非常高，均在 95%以上，其中美人梅与紫叶 李之间更是高达 99.3%。将序列在 Genbank 中 Blastn，结果发现 5 种李属植物与 己报道的 CHS 序列的同源性也达到 80%以上，证明成功分离到了 5 种李属植物 CHS 基因的 cDNA 序列。 关键词：李属；红叶性状；RAPD；CHS；克隆 The RAPD Markers Linked to the Red Leaf Traits of Prunus and cDNA Cloning of Chalcone Synthase Gene Author: Wen Liang Major: Silviculture Supervisor: Yang Jian-min Abstract Chalcone Synthase (CHS) is a key enzyme in the biosynthesis of all classes of flavonoids. Increase or decrease its expression in plant would change leaf color. In this study, five kinds of Prunus plant as the experiment materials, a molecular marker linked to the red leaf traits was detected with RAPD technology, which related with the formation of anthocyanins chalcone synthase gene cDNA sequence, specially expressed in Prunus, was cloned by homology cloning method. The main results were submited as follows: 1. P. salicina × P. atropurupurea and Prun