WB操作步骤.doc

Western Blotting试验步骤 组织蛋白提取 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充分混合。 注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。 注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 提取液中总蛋白的测定 用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。 配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内温度。 注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔， 稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20ul。 稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加稀释好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品点落在标准线1/2以后。 在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm， 根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。 注：1）标准曲线布板：（单位：微升） 试剂/孔编号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准品 0 2 4 6 8 12 16 20 PBS 20 18 16 14 12 8 4 0 工作液 200 200 200 200 200 200 200 200 样品蛋白布板： 试剂/编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2倍稀释 4倍稀释 10倍稀释 样品 9 9 9 4 4 4 2 2 2 PBS 11 11 11 16 16 16 18 18 18 工作液 200 200 200 200 200 200 200 200 200 空白对照布板： 试剂/编号 1 2 3 4 5 6 7 8 PBS 20 20 20 20 20 20 20 20 工作液 200 200 200 200 200 200 200 200 注：测蛋白浓度过程中，可将剩下的蛋白样品存放于4℃。待浓度测完，可拿一部分蛋白样品分装，5×SDS缓冲液，于沸水中煮5-10min使蛋白变性（也可以使用PCR仪进行变性，99℃，3-5min））））Image Lab软件→新建→凝胶成像→选择→印迹→Chemi→信号累计模式→第一个图像时间5s→最后一个图像时间200s→共30个图像→确定→放置凝胶→开始检测。注：开始检测前将凝胶成像仪右上角开关调至NO FILTER处，PVDF膜从TBST缓冲液中拿出后用滤纸吸干，放在事先平铺在凝胶成像仪中的保鲜膜上，PVDF膜上均匀滴入适量混匀的超敏发光液后保鲜膜覆盖，开始检测。超敏发光液需现用现配，整个过程需避光进行。 附：制胶配方 SDS浓缩胶配方表 各组分名称 凝胶体积所对应的上样量 10ml H2O 3.16ml 30%Acrylamide 0.5ml 0.5 M Tris.HCl(pH6.8) 1.26ml 10% SDS 50ul 10% AP（过硫酸铵） 25ul TEMED（灌胶前加） 5ul SDS分离胶配方表 各组分名称 各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量 5ml 10ml 15ml 20ml 6% gel H2O 2.6 5.3 7.9 10.6 30%Acrylamide 1.0 2.0 3.0 4.0 1.5MTris.HCl(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 10% AP（过硫酸铵） 0.05 0.1 0.15 0.2 TEMED（灌胶前加） 0.004 0.008 0.012 0.016 8% gel H2O 2.3 4.6 6.9 9.3 30%Acrylamide 1.3