新分子生物学课件20125.ppt

五、常用的PCR改进技术（PCR应用） （一）RT-PCR (reverse transcription PCR) RT-PCR是一种快速、简便、敏感性极高的检测 RNA的方法。 其基本原理是在逆转录酶催化下，以mRNA为模板合成互补DNA（cDNA），再以此cDNA为模板进行PCR 反应，使低丰度的mRNA得以扩增放大，便于检测。 该方法的关键步骤是RNA的逆转录，因此要求RNA模板必须完整。常用的逆转录酶有：鸟类成髓细胞白血病毒（AMV）的逆转录酶和莫洛尼鼠白血病毒的逆转录酶。 图7-13 RT-PCR原理和过程示意图 （二）定量RT-PCR ——通过设立RNA竞争性参考标准和利用PCR技术来定量分析基因表达的一种最快速、敏感的方法。 它与RT-PCR的区别：设立了RNA竞争性参考标准（RNA-CRS）。 1、内源性基因模板标准的选择与应用。（1）选择 选择那些在组织中普遍表达，且表达量比较恒定的一类mRNA作为内源性基因模板标准。编码这些mRNA的基因都是一些保守性强的管家基因，如β-肌动蛋白等基因。 （2）应用：①将这些表达量恒定的mRN稀释成不同浓度，分别与样本中的目的mRNA混合后，在各自不同的引物引导下共同逆转录，共同进行PCR扩增。 ② 将待测模板的扩增产物与内标准的扩增产物比较，当两者产物量相等时，待测mRNA量即与内标准mRNA相应的稀释浓度相同，从而达到定量的目的。 由于引物不同和mRNA的序列差异，扩增效率有一定差异，经过成百万倍放大以后差异就更大了，因此选择这类mRNA作为内标时，只能对目的mRNA进行相对定量分析。 2、体外构建RNA-CRS （1）参考标准构建 为了对目的mRNA进行精确定量，人们在体外构建了多种RNA-CRS。这些人为的RNA-CRS与目的mRNA在序列、大小和二级结构上相同或高度相似，可对目的mRNA进行精确定量分析。 以重组人SCF（stem cell factor）为例，构建RNA竞争性参考标准（图7-14）。 （2）应用 用SCF RNA-CRS对人重组SCF（干细胞因子）进行了定量TR-PCR分析。①将SCF RNA-CRS稀释成不同浓度；②分别与等量待测总RNA混合；③在相同条件下，用相同引物进行逆转录，形成cDNA； ④用PCR技术对cDNA进行共同扩增（用荧光定量PCR仪和被荧光素标记的dNTP） ⑤用软件分析DNA片段的荧光信号强度/每次扩增。⑥绘制PCR动力学曲线，确定达到平台期的循环次数（假如为22次达到平台期） ⑦选择指数扩增期进行QRT-PCR（20次）；⑧分析PCR结果：a、测定靶基因荧光信号和内标准荧光信号强度；以lg（校正内标准荧光信号/靶基因荧光信号）为纵坐标，[其中校正内标准荧光信号=（靶基因长度/内标准长度）×内标准荧光信号]以lg[RNA-CRS]拷贝数为横坐标（浓度）b、建立直线回归方程。c、绘制回归直线：回归直线与横轴的交点表示内标准和靶基因分子数之比为1∶1。即, 最初的靶基因分子数等于内标准分子数。 （三）实时荧光定量RT-PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR） 1．原理 （1）荧光染料（fluorescent dye, fluorochrome） 荧光基团通常有自己的单一光吸收峰，即能吸收某一特殊波长的光。荧光基团吸收激发光的能量后通常以三种方式释放出能量： ①光能； ②热能； ③转移给邻近的分子。 （2）荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET） 当某个荧光基团的发射光谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移。相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽（淬灭）。 （3）PCR扩增及其监测 荧光PCR独特之处是：在PCR过程中，能利用荧光染料释放的荧光信号变化直接反映PCR扩增产物数量的变化。由于荧光信号变量与扩增产物变量成正比，通过自动化仪器对荧光进行采集和分析，能够实现对PCR过程的实时监测，达到对原始模板定量分析的目的。 主要采用以下几种模式： ①仿溴乙锭着色检测, ②荧光标记引物 , ③荧光标记探针 : PCR体系中除常规扩增引物外，还需要针对扩增模板的特异性探针，探针结合的位置在引物对的中间。 A. 水解探针模式（hydrolysis probe） 采用双荧光标记探针（TaqmanTM 5-nuclease assay），利用Taq DNA聚合酶的5ˊ→3ˊ聚合酶活性及5ˊ→3ˊ外切酶活性，在链的延伸过程中实现链替换，并将被