新型PCR检测技术.ppt

第15讲 新型PCR检测技术 回顾上节课所学PCR 五个要素 ①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的Taq ④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤液态反应体系：其中Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 基本程序 ⑴94℃ 30s 变性 ⑵50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） ⑶72℃ n’(按1’扩增1kb计算）延伸 ⑷ 25-35个循环 基本内容 一、多重PCR 二、荧光定量PCR的原理 三、实时荧光定量PCR的原理 四、实时荧光定量PCR与常规的PCR的差别 五、实时荧光定量PCR的应用 六、课堂小结 七、作业 一、多重PCR 1、定义： 它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。 区别在多对引物需要设计。 2、多重PCR的步骤： ⑴多重PCR扩增区域的选择。 ⑵多对引物的设计。 ⑶反应条件的选择及反应体系的优化（引物浓度、模板浓度、dNTP及酶的浓度、Mg2+浓度、加入DMSO、甘油或者BSA、PCR循环参数的设定）。 ⑷结果分析 3、多重PCR的特点 ①高效性 在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。 ②系统性 多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。 ③经济简便性 多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。 4、多重PCR的应用（5个实例） 例一 肝炎病毒的感染，在同一病人体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染。有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠. 4、多重PCR的应用（5个实例） 例二 肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病. 4、多重PCR的应用（5个实例） 例三 性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断. 战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检. 需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等. 4、多重PCR的应用（5个实例） 例四 某些遗传病及癌基因的分型鉴定。遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位 ，通过常规PCR很难检测出来。 例五 植物种质鉴定、植物病毒的检测、分子育种、快速检测外源基因的整合状态。 二、荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 二、荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。 1、 荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5→3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。 1、荧光探针 1、荧光探针 1、荧光探针 1、荧光探针 1、荧光探针 2、荧光染料 在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 2、荧光染料 2、荧光染料 荧光探针 特异性高 探针设计要求高 合成费用高 多重PCR检出 荧光染料 简便易行 价格便宜 要求反应的特异性 不能进行多重PCR 荧光探针 SNP解析 病毒、病原菌的检测 荧光染料 mRNA表达量分析 三、实时荧光定量PCR的原理 1、Ct 值 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 -