生物技术综合实验(二).ppt

3．上样： （1）放去床表面上的缓冲液至与凝胶界面平齐。 （2）用进样器吸取酶液0.5ml，加样时将进样器尖端接触柱内壁并在离床表面数毫米处随加随沿内壁转动一周，使样品尽快分布于全表面。然后打开恒流泵，待样品液面与床柱表面平齐时，关闭恒流泵，以少许（0.1—1ml）缓冲液冲洗内壁数次，在打开恒流泵，放至液面与床柱表面平齐。 （3）先用进样器加1cm高度的缓冲液覆盖样品，然后加足缓冲液，连接好进液管。 4．洗脱： 开启部分收集器和恒流泵，以pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液进行洗脱。调节流速，控制每管收集洗脱液1ml，每管按收集顺序做好标记。 5．洗脱液酶蛋白含量的测定： ： （1）取洁净试管数支，分别加入考马斯亮蓝溶液3ml,摇匀，将其中一支试管不加任何试液作为对照管，其余的分别加入从第五收集管起的洗脱收集液50μl,反复摇匀。 （2）以对照管为调零液，用1cm比色杯在595nm波长下测定各管的OD595nm值。 （3）合并OD595nm值高的原收集液，此即纯化的SOD酶液。保留测酶活力。 （4）测定完毕，先用乙醇洗去比色杯的颜色，再用蒸馏水荡洗，用擦镜纸拭干水珠，倒扣在培养皿内。 （5）清理干净工作台，在仪器使用登记本上登记使用情况。 （三）SOD酶活力测定 　　在一般情况下，SOD活性测定只能应用间接活性测定法。其测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2?-，利用SOD分解而间接推算酶活力。 　　在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。 邻苯三酚自氧化法原理： 　　　邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2?- （超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2?-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出SOD的酶活性 。 　　　　　　　 邻苯三酚─────── O2?- + 红桔酚 　　　（自氧化：有色物质积累，吸光值增加） 　　 　O2?- + O2?- +2H+────H202+O2 　　　（SOD催化：阻止中间产物积累，吸光值降低） pH=8.2 SOD 实验步骤： 1．测定邻苯三酚溶液自氧化速率： 　取两支试管按右表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L?HCl代替邻苯三酚?），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.070士0.002（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。 试剂 空白管（mL） 自氧化管（mL） pH8.2、50mmol/LTris-HCl 4.5 4.5 10mmol/L HCl 0.01 —— 45 mmol/L邻苯三酚 —— 0.01 2.SOD样液活力测定： 　样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，在 25℃水浴锅中保温10min，再加入预热的邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定 。 试剂 空白管（mL） 样品管（mL） pH8.2 50mmol/LTris-HCl 4.5 4.5 10mmol/L HCl 0.015 —— SOD样酶 —— 0.005 45 mmol/L邻苯三酚 —— 0.01 3. 数据处理 3.1 加入SOD酶前后邻苯三酚自氧化速率的计算 时间 30s 60s 90s 120s 150s 180s 210s 自氧化 大豆提取液 SOD标准品 3.2 SOD酶活力计算： (酶活力单位定义:在一定条件下,每1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50 %时的酶量定义为一个活