ELISA试剂盒法和HPLC法检测大麦中呕吐毒素的比较.docVIP

ELISA试剂盒法和HPLC法检测大麦中呕吐毒素的比较 　　摘要：目的：通过比较两种方法对呕吐毒素的检测结果，验证呕吐毒素ELISA试剂盒快速检测法的准确性。方法：大麦样品经过不同的前处理提取后分别进行ELISA和HPLC检测，并进行加标回收试验。结果：试验在0～800μg/kg加标浓度范围内，ELISA试剂盒法和HPLC法检测结果接近，平均回收率分别为91.9%和83.7%，变异系数（RSD）均低于10%。结论：相对于HPLC法，呕吐毒素ELISA试剂盒法操作简单快捷、检测时间短，灵敏度高、稳定性好，适用于大批量大麦样品中呕吐毒素含量的定量快速筛选。 　　关键词：大麦 呕吐毒素 ELISA HPLC 　　中图分类号：TS210 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）14-0029-02 　　目前粮谷类食品中呕吐毒素的分析方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和免疫法等，其中免疫法有酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫等。ELISA是一种准确、灵敏、特异性强的快速检测技术，在有害物质的快速检测中占有重要的地位。笔者对ELISA试剂盒法和HPLC法检测大麦中呕吐毒素的结果进行了比较，从而验证了试剂盒法的准确性。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 　　Waters高效液相色谱仪，Waters公司；旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司；MK3型酶标仪，美国Thermo公司；电子精密天平，德国Sartorius公司；大麦粉碎机，上海微型电机厂；床式振荡器，广州富城仪器厂；微量移液器，德国Eppendorf公司；呕吐毒素ELISA试剂盒，美国Beacon公司；呕吐毒素标准品，纯度≥99%，美国sigma公司；甲醇为色谱纯；水为超纯水；0.45μm微孔滤膜。 　　1.2 ELISA法 　　大麦样品经粉碎后，准确称取10.00g到120ml有盖PP瓶中，加入100mL蒸馏水，置于床式振荡器剧烈震荡3min，定性快速滤纸进行过滤，滤液待用。 　　实验前提前取出呕吐毒素试剂盒回温，确保标准液、试剂、清洗液恢复至室温20～28℃，取适当数量的微孔固定在微孔板架上。 　　加入50μl的DON标准液（0、8、20、40、100μg/l）及样品提取液到相应的微孔中，然后加入50μl酶标记物溶液到各个微孔中，再加入50μl抗体溶液到各个微孔中，轻微震荡微孔板，于室温下准确孵育10min。 　　孵育完毕倒掉微孔中的溶液，用清洗液重复洗板五次，充分拍干。每孔加入100μl底物溶液，室温下准确孵育5min。每孔加入100μl停止液，用酶标仪读取450nm波长下各孔的吸光值。 　　1.3 HPLC法 　　（1）样品预处理。准确称取粉碎后的大麦样品 10.00g到250mL具塞三角瓶中，加入100ml10%甲醇-水溶液，250rpm振荡提取30min，定性快速滤纸过滤后取20mL滤液，于50℃下旋转蒸发干，用2mL20%甲醇-水溶液洗脱定容，过0.45μm滤膜后待用。（2）液相色谱工作条件。色谱柱采用Waters Nova-pakC18（3.9×150 mm，4μm），流动相为甲醇-水溶液（20：80，v/v），柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长220nm，进样量为10μl。 （3）呕吐毒素标准曲线。用10%甲醇-水溶液将呕吐毒素标准贮备液配制成100、200、500、1000、2000μg/l的系列标准工作液，进行分析后绘制标准曲线。其回归方程为：Y=25.293X-242.45，线性相关系数R2=0.9991，呕吐毒素在100～2000μg/l的浓度范围内和峰面积具有较好的线性关系。 　　2 结果与分析 　　往大麦样品中添加一定浓度的呕吐毒素标准品进行加标回收试验，每个水平浓度重复3次，样品经不同预处理后分别通过ELISA法和HPLC法进行分析，从而验证方法的准确性。结果见表1。 　　对ELISA法和HPLC法的检测结果进行线性比较，结果见图1。 　　由表1可知，大麦样品经HPLC法检测加标回收率在79.5%～88.2%之间，RSD在10%以内；经ELISA法检测加标回收率在84.7%～101.5%之间，RSD低于10%。由图1可知，两种方法检测结果的一致性较高，线性相关系数R2=0.9892，表明呕吐毒素ELISA试剂盒法具有较高的准确性，可以保证检测结果的可靠性。 　　3 讨论 　　ELISA试剂盒法基于抗原抗体的特异性反应，特异性强、灵敏度高，与HPLC法相比，样品前处理方法得到了简化，操作快速、简单，可以较少接触有毒有害物质从而增加实验安全性。目前国标中规定大麦中呕吐毒素含量为1000μg/kg