MicroRNAs在垂体腺瘤中作为新的生物学标志的意义.docVIP

MicroRNAs在垂体腺瘤中作为新的生物学标志的意义 　　摘要：先在垂体腺瘤组织、血清中比较miRNAs的差异表达，然后寻找出有统计学意义的miRNAs。收集临床确诊垂体腺瘤病例，应用基因芯片检测出miRNAs，应用foldchange方法，选取foldchange大于等于2或小于等于0.5的miRNAs作为两组样本具有差异表达的miRNAs。通过计算机模拟寻找出同时存在于组织、血液中的miRNAs。对随机抽选的一个miRNA应用实时定量PCR方法进行验证。找到同时存在于肿瘤组织、血清中的miRNAs10个。应用实时定量PCR验证，验证发现有统计学意义且结果一致。 　　关键词：垂体腺瘤；MicroRNAs 　　垂体腺瘤是常见的位于颅内的良性肿瘤，约占所有颅内肿瘤的10～25%。其发病机制大部分仍是未知的，现表明垂体腺瘤的发生是一个涉及多个因素，包括遗传和表观遗传变化的复杂过程。MicroRNAs（miRNAs）是小的非编码RNA，通过反向的靶向调节mRNA的基因表达从而促进癌症的发生和发展。已有文献描述了垂体腺瘤中MicroRNAs表达的改变，并且特定标记的miRNAs已经涉及到了肿瘤的临床治疗。 　　垂体瘤按生物学特性分为侵袭性垂体腺瘤、非侵袭性垂体腺瘤和垂体腺癌。其发生机制是原癌基因突变与表达、抑癌基因杂合丢失、细胞信号转导及转录因子紊乱、细胞周期调节失控与下丘脑激素受体异常等机制共同作用的结果[1]。而miRNAs在垂体腺瘤的细胞凋亡、增殖、分化中的作用，以及其在垂体腺瘤中的表达与差异，均提示miRNAs在垂体腺瘤发病机制中起着重要作用[2]。Bottoni等最早报道人类垂体腺瘤中miRNAs表达。之后在研究与垂体腺瘤相关miRNAs中有了一系列的发现。最近研究发现，血循环及其他体液中也存在稳定且相关的miRNA[3]。大量文献证明，miRNAs对细胞因子的调控可以影响到垂体腺瘤的临床表现甚至参与药物-靶垂体的作用机制。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 收集了2013年4月～2013年11月间共60例进行垂体腺瘤手术患者垂体腺瘤组织、血清标本。按照Wilson改良的Hardy分级分型法经过筛选，比较典型侵袭性垂体腺瘤5例，非侵袭性垂体腺瘤5例。 　　1.2miRNAs基因芯片检测第一步，RNA抽提和纯化；第二步，样品RNA的标记；第三步，芯片杂交；第四步，芯片扫描及差异miRNAs筛选。 　　1.3实时定量PCR（real-timePCR，RT-PCR）验证选取miR-142-3p，用mir-和U6snRNA特异性引物：miR-142-3p，5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG 　　ACTCCATAAAG-3；U6snRNA，5-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3，将标本中的总RNA，反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。MiR-142-3上游引物序列为5-CGCCGTGTAGTGTTTCCTAC-3，下游引物序列为5-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3；U6snRNA，上游引物序列为5-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3；下游游引物序列为5-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3。PCR扩增反应条件如下：第一步，94℃3min；第二步，94℃30s、60℃45s、72℃30s，共45个循环。其中U6作为内源性对照[4]。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。 　　1.4统计学方法 应用SPSS13.0统计软件对实验数据进行处理。 　　2结果 　　2.1找到同时存在于肿瘤组织、血清中的miRNAs5个 见表1。 　　2.2应用RT-PCR法对有差异表达最大的miRNAs进行验证，发现结果一致。 　　3讨论 　　miRNAs是微小RNA分子，通过多种机制调节抑癌基因和原癌基因的表达来参与肿瘤的发生发展，本实验将确诊为垂体腺瘤患者分为侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤两组，进行组间对照，发现存在多种具有差异表达的miRNAs，并且结果提示组织中存在的miRNAs也可以同时存在于血清中。假设可以通过miRNAs来指导用药或将miRNAs作为侵袭性指标，那么在临床诊疗中，可以通过抽血检测miRNAs，就能起到诊断、指导、甚至预防作用，而不用等到术后的组织学检测。可见miRNAs在垂体腺瘤中作用机制的研究是个新兴的、极有价值的的医学研究领域。 　　参考文献： 　　[1]魏俊吉，张波，王任直，等.侵袭性垂体腺瘤发病机制及诊断标准的研究进展[J].中国微侵袭神经外科杂志，2005，10（10）：478-480.