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乳腺癌HER2状态检测方法对比的研究 　　【摘要】 　　目的：应用荧光原位杂交技术（FISH）检测乳腺癌组织HER2基因状态，与免疫组化（IHC）检测HER2蛋白表达结果进行比较，探讨FISH检测HER2基因的临床意义。方法：采用FISH检测方法检测200例乳腺癌患者的癌组织HER2基因状态，与已知的IHC检测结果进行对比分析。结果：FISH检测结果，HER2基因扩增59（29.5%）例，HER2基因无扩增141（70.5%）例。IHC结果为（-/+）的患者中，HER2基因扩增20例，HER2基因无扩增135例；IHC结果为（2+）的患者中，HER2基因扩增20例，HER2基因无扩增5例；IHC结果为（3+）的患者中，HER2基因扩增19例，HER2基因无扩增1例。IHC结果为（-/+）和（3+）的样本与FISH结果的一致性上尚可（Kappa=0.581，P0.05）。结论：综合各方面影响因素，IHC可作为HER2初筛检测方法，针对IHC（2+）的患者需要进行FISH检测进行确认。 　　【关键词】乳腺癌；HER2基因；荧光原位杂交；免疫组化 　　乳腺癌是妇女中常见的恶性肿瘤之一，在西方国家其发病率和病死率居肿瘤之首。很多研究表明很多基因与乳腺癌的发生发展有关联，其中HER2基因与乳腺癌发生、发展及治疗关系较为密切。人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2），又称为c-erbB-2，是一种原癌基因，属于Her/erbB家族，位于染色体17q12，编码分子量185KD的跨膜糖蛋白，是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜生长因子受体的信号传导，通过细胞间调节细胞生长、生存、分化和增殖[1]。研究表明，20%～30%的乳腺癌患者会出现 HER2基因异常扩增或过度表达，显示预后不良，此类患者进一步使用HER2 蛋白人源性单克隆抗体herceptin（赫赛汀）进行靶向治疗，可以得到明显的治疗效果[2]。因此准确检测乳腺癌的HER2状态至关重要。 　　目前临床上，检测HER2状态的方法主要有两种：一种是免疫组织化学（IHC）检测HER2蛋白表达状态；另一种是荧光原位杂交（FISH）检测HER2基因状态。国外许多研究[3-5]表明：IHC和FISH 之间的比较，一致性在73%～98%。本文研究这两种检测方法的一致性，选择合适的检测方法，为临床个体化治疗方案的制定，选择合适的靶向药物提供更可靠的实验依据，同时减轻患者的经济负担。 　　材料与方法 　　1. 标本来源 　　手术切除的乳腺癌标本200例，标本经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋。经免疫组化检测HER2蛋白表达+++：20例，++：25例，-/+：155例。 　　2. FISH检测 　　1） 探针采用乳腺癌HER2/neu（17q12）/TOP2A（17q21）/CSP17多色检测试剂盒（荧光原位杂交法）由广州安必平医药科技有限公司生产。 　　2） 样本预处理：石蜡切片56℃烤片过夜。将切片放入室温二甲苯中2次，10分钟/次→100%乙醇，10分钟→100%乙醇，3分钟→90%乙醇，3分钟→70%乙醇，3分钟→纯化水，3分钟→95±5℃纯化水中煮片25分钟→胃蛋白酶消化5～10分钟→2×SSC洗涤2次，5分钟/次→70%乙醇，3分钟→90%乙醇，3分钟→100%乙醇，3分钟，自然干燥。 　　3） 杂交：取10μl杂交液滴于组织标本上，盖上盖玻片，橡胶水封片。将标本放在杂交仪中，85℃变性5 分钟后，37℃杂交过夜。 　　4） 洗涤：次日取出标本，去掉橡胶水，在37℃水浴条件下洗涤， 2×SSC洗涤10分钟→2×SSC /0.1%NP40中洗涤5 min→室温条件下进行脱水，70%乙醇，3分钟→90%乙醇，3分钟→100%乙醇，3分钟→自然干燥后DAPI复染剂复染。结果观察采用荧光显微镜，分析软件采用Iminstar染色体图像分析软件。 　　3. FISH结果判读 　　相关荧光和DAPI需用合适的滤块观察。其中，GSP HER2探针为红色信号；GSP TOP2A探针为绿色信号；CSP17探针显示青色信号。 　　阈值设定，在清晰的肿瘤区域中，计数60个细胞，统计比值（HER2：60个细胞中红色信号总数/60个细胞中青色信号总数）。 　　HER2基因判读标准： 　　HER2基因扩增：GSP HER2 / CSP17（红色/青色）≥2.2； 　　HER2基因无扩增：GSP HER2 / CSP17（红色/青色）1.8； 　　若GSP HER2 / CSP17（红色/青色）的比值在1.8～2.2之间，属于临界值，需要再计数20个细胞核中的信号，或由另一位实验人员重新计数，进行最终判读