核酸提取及常见问题课件.ppt

DNA提取的几种方法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－煮沸法 细胞器DNA－差速离心法 内容 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 内容 RNA提取的通用方法 RNA提取的通用方法 影响RNA提取的因素 影响RNA提取的因素 内容 RNA提取常见问题 RNA降解 RNA降解 OD260 /OD280 比值偏低 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 RT常见问题分析和解决方案 RT常见问题分析和解决方案 RT常见问题分析和解决方案 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 设备限制： 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 用水稀释样品： 测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。 非变性电泳： 上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。 RNA 降解 抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA 问题一：少量或没有RT-PCR产物 PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物 反转录成功，PCR失败 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，提高逆转录反应温度 RNA模板存在较多二级结构 确定退火温度适合所用的引物 合成cDNA第一链合成的引物退火失败 用氯化锂沉淀RNA以除去多糖 多糖同RNA共沉淀 增加RNA的量 起始RNA量太低 70％（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂 RNA中含逆转录酶抑制剂 分离无污染，高质量的RNA；防止RNA降解 RNA降解 可能原因 解决方案 问题二：有非特异性带 引物和模板的非特异性退火 基因特异性引物设计较差 RNA中有基因组DNA的污染 形成引物二聚体 镁离子浓度太高 提高反应的温度和特异性 提高引物的特异性 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA 设计在3端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度 可能原因 解决方案 * 　基因组DNA的提取 　CTAB法 　SDS法 　其它 　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB