实时荧光定量PCR原理课件课件.ppt

实时荧光定量PCR 主讲人：廖旭东 PCR定义 PCR 简称聚合酶链式反应。聚合酶链式反应，是指在体外，酶促合成特异性DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火和适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。 DNA聚合酶以单链DNA为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。 PCR反应条件 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 对于较短靶基因可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 温度与时间的具体分析 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 温度与时间的具体分析 ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长 度。 温度与时间的具体分析 对于20个核苷酸，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。 复性温度=解链温度-(5～10℃) 在解链温度允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 温度与时间的具体分析 ③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 温度与时间的具体分析 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1-2min是足够 的。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数： 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 实时荧光定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。 如何检测荧光强度呢, 我们先来了解一下荧光探针。 荧光共振能量转移 要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念我们需要首先明确，那就是荧光共振能量转移( FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体和能量受体对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。所以我们就检测不到它的荧光。 接触过PCR的同学与同事不知道有没有想过，为什么同一浓度的标本在纵坐标中最后的荧光强度会不同，同时有时候1X105的荧光强度跑得会比1X107还高？带着这个疑问我们先来看看第三点：CT值。 那CT值的特点是什么呢？我们为什么选择CT值这个参数来测算样本的浓度？让我们来看看CT值的特性。 模板的浓度与CT值有必然联系，它极具重现性，而和最终的荧光值的大小没有太大必然的联系，有孔间差异（另非特异）。这就解释了我们之前的为什么同一浓度的标本纵坐标的最后的荧光强度会不同，同时有时候低浓度的荧光强度跑得会比高浓度的还高了。 扩增曲线、荧光阈值、Ct值这几个概