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Elisa 实用操作手册 给师弟科普ELISA基本步骤。与其写个文档，不如直接写帖子，反正工作量一样。我自己做ELISA也只是初学者，所以说得不对的地方，请大家多多指正。ELISA有白底（上图，不可拆）和黑空板子（可拆，8个一排，12排）。用吸光度（一般是450nm的OD值）来检测，就只能用白底的板子。黑底的板子可以用Lumin读数。第一步，拿到板子，还有封盖膜。 第二步：用100ul包被抗体，包被好板子之后，轻弹混匀。将封盖膜的白色撕去，用透明有粘性的膜，贴在板子上，把膜压紧（贴膜是为了防止液体挥发，所以一定要把每孔黏牢）。室温孵育过夜。注意事项：1.如果一次只做一部分孔，贴膜可以剪刀剪开，只用一部分。保证膜可以把加液后的孔盖住就可以。2.加样时候，一定要保证每孔加样量完全一样。避免因为操作原因，每孔液体量有区别。ELISA比较敏感，操作误差会导致最后读数有不小的差别。3.加的样，保证样品加在孔底，不要粘在管壁上，减少孔与孔之间的差异。 第二天早上，来洗掉包被液。注意事项：1. ELISA用的所有液体系统，记得一定要预先调PH值到7.2-7.4之间，最好按照说明书都无菌过滤过。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加盐酸调酸一点。Trizma base配出来，PH在9.98,必须调PH!否则ELISA中抗原抗体根本不能正常结合。蛋白对于PH值极度敏感。2. 无菌要求多高，现在不知道。建议无菌配好的液体放在4度冰箱保存。每次用之前，放在室温下至少15分钟。ELISA用的液体，室温的温度，效果比较好。洗包被液的时候，直接把板子翻过来，弃掉液体。在厚厚的吸水纸上，用力拍打板子，力求把孔中的液体完全弃干净。用WASH BUFFER洗涤三次。因为孔的最大容量是400UL,但是300UL基本就可以把孔覆盖满。所以，建议洗板子的时候，每孔加350ul左右。注意事项：1.每次洗涤的时候，尽量拍干孔中液体。这样洗涤得比较干净。2. 孔中没有液体时候，动作一定要快！！！ELISA包被后的孔，绝对不能干掉！否则非常影响结果。 3.封闭。用是1%BSA in 1XPBS. 无菌过滤，4度保存，用之前放在室温复温。封闭液最好可以封闭全孔，所以每孔加300UL封闭液，室温1小时。 4. 弃掉封闭液，拍干。洗涤三遍。步骤如前。 5. 加标准品和样品。标准品储存浓度很高，而且蛋白很忌反复冻融。建议第一次使用时，分装。可以48孔一只，-80度冰箱保存，可以有效保存半年。4度保存，有效期是60天，而且浓度会衰减。 取16孔标准品的量。举例，我的标准品储存浓度是270ng/ml, 标准品分7个点，最高浓度是1000pg/ml，每孔100ul, 2倍递减，所以是1000， 500， 250， 125， 62.5 ， 31.2， 15.6 pg/ml, 7个孔我需要0.2ng标准品。做ELISA必须有复孔。所以，两排14个孔我需要0.4ng标准品, 1.5ul。标准品稀释步骤：取7个EP管，第1管放400ul缓冲液，第2到7管放200ul缓冲液。将1.5ul标准品加入到第一管中，200ul枪轻轻吹打混匀。从第1管中取200ul加入第2管中，吹打均匀。依次稀释。第7管有400ul液体，最后只用200ul。标准品加样步骤：从第1管中取100ul加到A1孔，再100ul加到A2复孔中。第2到7孔，参考上述步骤。第8孔，H1和H2加没有标准品的缓冲液，作为阴性对照。样本加样：血清或者细胞上清，解冻之后混匀，建议3000RPM离心10分钟，沉淀液体中的固体杂质。按照顺序，每孔加100ul样本，记得做复孔。加样体积一定要一样，但是动作要快。样本还是一定要保证加到管底，不要粘附到管壁上。 标准品和样品，每孔100ul，室温孵育2小时。 6. 弃掉液体，拍干。洗涤3遍。 7. 加检测抗体（detection antibody,尾端有生物素biotin），每孔100ul（储存液也是放-80度，用之前解冻后加缓冲液混匀，稀释到工作浓度，缓冲液的PH值都已经调到7.2-7.4之间）。室温孵育2小时。备注：以上这些步骤没有要求避光。所以，每次加样之后，只要保证把贴膜都贴牢，防止液体蒸发和孔间干扰即可。板子可以放在操作台上。不过因为操作习惯，即使不避光的步骤，也可以把板子放在室温的抽屉里。 8.弃掉检测抗体液，拍干。洗涤三遍。9. 加Streptavidin-HRP(亲和素-辣根过氧化物酶)，这个一直4度保存，使用的时候200倍稀释（96孔，9.6ML液体，加48ul的Streptavidin-HRP，9552ul的缓冲液）。100ul每孔，室温，避光（这步开始要避光），孵育20分