实验14-PCR技术课件.ppt

5’ 3’ F Q Tubulin 5’ 3’ H Q GapdH 5’ 3’ TX Q b-actin 5’ 3’ Cy5 Q Cyclophilin 多色荧光检测技术 ——同时检测4色荧光 3、荧光定量PCR的应用 相对定量：基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核 绝对定量：基因表达研究、病原体检测、转基因食品检测 相对定量 参考基因：Actin, GAPDH, 18sRNA 1.3 20.8 22.1 实验组 5.7 19.5 25.2 对照组 ΔCt GAPDH 靶基因A 1．计算ΔCt：ΔCt=Ct 靶基因－Ct GAPDH，分别计算实验组和对照组的ΔCt。 2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，本例中ΔΔCt= －4.4。 3．计算相对表达量的差值。2 －ΔΔCt 绝对定量 构建标准曲线： A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。 B、利用纯化的扩增产物制备 C、克隆有扩增产物的质粒 标准品的选择： 标准品可以从厂家购买，也可以自己制备 标准品的单位，取决于对最终结果的要求：拷贝数，%，ng/uL, mol/uL（如：如果要得出的是样品中的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的DNA）  荧光强度的校正 影响荧光信号强度的因素包括： 光源强度、管盖透光性能 缓冲液用量、反应体积、PCR反应强度等等 以扩增前的荧光探针本底信号为依据，荧光强度归一化校正。 内参照荧光Rox校正。 PCR扩增效率的校正 利用多色荧光检测技术对内标荧光的检测可校正PCR扩增效率误差。 实验误差校正技术——准确定量 （六）兼并引物PCR（Degenerate Primer） 1、密码子的兼并性 氨基酸　　　　　　　　　　　　　　　　密码子数 Ｍ、Ｗ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｙ　　　　２ Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ　　　　　　　　　　　　４ Ｌ、Ｒ、Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　６ 2、概念 兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。 （七）巢氏PCR（Nested PCR） 巢氏PCR需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增15-30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15-30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。 若将套失PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（25-30bp），同时缩短内引物长度（15-17bp），使外引物先在高退火温度下复性，做双温扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入。 （八）反向PCR（Inverse PCR） 1、概念 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又称为染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA两末端序列互补，但引物3’端是相互反向的。 2、反向PCR的操作流程： 扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。 Inverse PCR 限制酶切点（X） 限制酶切点（X） 已知序列 限制酶X酶切 连接 引物2 引物1 PCR （九）不对称PCR（Asymmetric PCR） 1、不对称PCR的基本原理： 采用不等量的引物产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1:50-1:100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于ss-DNA。 2、不对称PCR反应过程： 一般来说，在不对称PCR反应中，在开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链DNA，当限量的那个引物耗光后，随后的5-10个循环就产生出ssDNA。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同，可以通过电泳分离。 3、ssDNA产物量： 一般对100μl PCR反应体系而言，当引物比率为50pmol:0.5pmol，经过30个循环后，大约可产生1-3pmol的ssDNA。ssDNA