实验一、16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析课件.ppt

FASTA格式文件 找到刚才保存的文件 实 验 结 果 电泳图片（表明样品名称和Marker 分子量，目的片段大小） 构件一个系统发育树 马玉超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话 Email:myc0307@ 现代微生物学实验技术 实 验 内 容 ?16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析 ?染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ? 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ? 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ? 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 16S rRNA基因的PCR扩增、电泳 及系统发育分析 窦 桂 铭 实 验 目 的 掌握PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 掌握电泳技术及系统发育分析的方法，为将来课题研究奠定基础。 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序 设想—实现—改进与完善 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 PCR技术的反应原理 PCR技术的反应原理 DNA或RNA模板 5′ 5′ 待扩增DNA区域 3′ 94℃ 5 min 5′ 5′ 55℃ 退火 5′ 5′ 聚合 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 循环25-30次 变性 70℃ DNA引物 DNA聚合酶 dNTPs Mg2+（缓冲液） 1 2 ① 5′ 5 ′ 目的基因 变性 加热 5 ′ 5 ′ 引物 退火 5 ′ 5 ′ 底物 延伸 5 ′ 5 ′ 5 ′ 加热 变性 5 ′ 退火 引物 2 30个循环：230 目标DNA片段达106-107 变性－退火－延伸 5 ′ 5′ 2 4 5 ′ 5 ′ 5′ 5 ′ 5 ′ 延伸 5′ 5 ′ 5 ′ 5 ′ 5 ′ 一个标准的PCR过程 核酸的凝胶电泳 基本原理 当一种分子被放置在电场中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。 迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。 在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的——叫做多聚阴离子。方向：负→正 种类： 水平 垂直 琼脂糖 聚丙烯酰胺 普通DNA RNA 小分子量 核酸 二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。 加热→凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围: 0.2-50kb 凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp） 0.5% 1,000～30,000 0.7% 800～12,000 1.0% 500～10,000 1.2% 400～7,000 1.5% 200～3,000 2.0% 50～2,000 琼脂糖 DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响： 核酸 分子量的大小 分子状态 物理 电压 缓冲液 温度 电泳指示剂：溴芬兰，距边缘1cm左右停止电泳。 电泳染色剂：溴化乙锭(ethidium bromide,简称EtBr)， 扁平染料， 嵌到DNA或RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。 DNA Marker 1.2kb 800bp 操 作 步 骤 成 分 贮液浓度 使用量(20μl体系) 水 —— 14μl 10×GC Buffer Mg2+ Plus 2μl dNTPs 2.5mmol 0.5μl 16Sp1 10pmol/μl 1 μl 16S p2 10pmol/μl 1μl 基因组DNA 100μg/ml 1μl Taq酶 5U/μl 0.5μl 循环次数 反应条件 1 95℃（10min） 30 94℃；30s 58℃ ；1min 72℃ ；1min30s 1 72℃ ；10min 1 72℃ (10min) 操 作 步 骤 (1) 称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1×TAE)配成所需浓度的胶；10×TAE 缓冲