实验十二 氨基转换反应的定性鉴定课件.pptVIP

3、氨基转换反应的定性鉴定 学习一种鉴定氨基转换反应的简便方法 掌握纸层析的原理和操作技术 体外氨基转换反应原理 实验原理 转氨酶能催化α -AA的氨基与α -酮酸的α-酮基互换，生成一种新的氨基酸和新的α-酮酸，这种反应称为转氨作用。它在体内蛋白质合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质之内物质代谢的相互关系、相互转化上都起着重要作用。 任何一种氨基酸的转氨基反应都由专一的转氨酶催化，其最适pH接近7.4。其中Glu-草酰乙酸转氨酶及谷氨酸-丙酮酸转氨酶活力最强。当机体发病时，如肝炎、心肌梗塞等，血清中转氨酶活力显著增加。测定转氨酶活性的方法有分光光度法、纸上层析、光电比色法。 为防止丙酮酸被组织中其它酶氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸以抑制酵解或氧化作用。 氨基转换反应 纸层析检测原理 滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素，纤维素的— OH基为亲水性基团，因此可吸附一层水或其它溶剂作为固定相。通常把有机溶剂作为流动相。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后，该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中，有机溶剂自下而上移动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相对溶质进行连续的抽提，物质在两相间不断分配的结果即得到分离。 纸层析检测 Rf值的定义 物质分离后在图谱上的位置，可用比移值 Rf来表示，Rf值的定义是：从溶质层析的起点(原点)到层析斑点中心的垂直距离与从原点到溶剂流动的前沿的垂直距离的比值： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以 Rf值的主要决定因素是分配系数 (α)。对于每一物质在一定条件下α值是固定的，因此Rf值为其特征常数，可做为定性鉴定的参考数值。 影响 Rf值的主要因素 1.物质结构对于Rf值的影响 2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响 3.pH对Rf值的影响 4. 滤纸对Rf值的影响 5.温度对Rf值的影响 转氨基反应的定性鉴定原理 无色物质的层析图谱可用光谱法 (如核苷酸类物质用紫外光照射)或显色法鉴定。氨基酸纸上层析图谱常用的显色剂有茚三酮、吲哚醌。 本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH，时间影响较大。如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。样品中含大量盐时显色点上会出现白斑，空气中其它的杂质如氨，硫化氢或酚等皆会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定，用硫酸铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，可以通过比色法定量测定氨基酸含量。 转氨基反应的定性鉴定原理 预期的实验结果 思 考 影响转氨基作用的因子有哪些？ 实验过程中应注意些什么？ 网上查询有关转氨酶的研究动态。 * 试管号 酶液 15%三氯乙酸 1%Glu 1%丙酮酸 0.1%碳酸氢钾 0.05%碘乙酸 1 10d 10d,10min 10d 10d 10d 5d 2 10d 10d 10d 10d 5d 37℃-40℃反应1.5小时，经常摇动确保反应进行完全。保温后取出第2号试管，加入15%三氯乙酸10d，沉淀蛋白终止反应。将两只试管中的内容物转移到离心管中，2500rpm/min离心5min，将上清转移到干净的试管中备用。 纸层析是以滤纸为载体，用一定的溶剂系统展开而达到分离、分析目的的层析方法。此法可用于定性，亦可用于分离制备微量样品。 20ml展层剂饱和20min 点样 展层2小时左右 显色 37℃保温1.5小时 氨+还原茚三酮 氨+还原茚三酮 水和茚三酮 紫色物质 *