07(实验)碘标记物的纯化与鉴定NEW课稿.ppt

实验步骤 将滤纸条浸于1%KI溶液中过夜，次日取出晾干。 从无孔端用铅笔以1cm等距离画10~12条线。 在第一线出点样5~10ul125I标记物晾干。 将此滤纸条放入层析槽中，使末端浸于展开剂中约5mm 2小时候取出纸条晾干，然后沿线剪开，分别放入相应试管中编号标记。 每管内加入0.5mlH2O,并记录数据及作图。 实验结果 下面将以管号为横坐标，每管的cpm为纵坐标作图。 ALB EPO 实验计算及分析 如图所示： ALB的放化纯度= cpm1+cpm2+cpm3 cpm总 ×100% ≈65% EPO的放化纯度= cpm1+cpm2+cpm3 cpm总 ×100% ≈90% 分析： ALB放化纯度＜90%可能原因为：①层析时间不足，未充分分离 ②样品过期，有杂值出现。 EPO放化纯度=90%，结果较理想。 注意事项 1、点样时要轻快，点样面积要尽量小 2、各层析纸应标明点样名称及有效期 3、层析时间要充分，需1.5小时或以上 4、展开时，标记物切勿侵入展开剂中 凝胶过滤法 葡聚糖凝胶过滤法 琼脂糖凝胶过滤法 聚丙烯酰胺过滤法 分类 示意图 注意事项： 根据抗原分子量选择凝胶和层析柱 层析柱要新鲜制备 选择合适的洗脱液，洗脱速度不超过0.5ml/分 多数标记抗原在分离纯化前先用蛋白（BSA或RSA）保护 洗脱液用部分收集器收集，所用的试管应先用蛋白处理 有时须经两次纯化，得到高质量的碘化标记物 125I-标记物柱层析分离纯化示意图 Ⅰ.损伤和聚合标记物 Ⅱ.125I标记物 Ⅲ.游离125I- LOGO LOGO ≈≈≈ 抗体滴度的确定  碘标记物的纯化与鉴定 内容 一、抗体滴度的确定 二、碘化标记物游离碘鉴定方法 三、碘化标记物放化纯度 一、抗体滴度的确定 通过本次实验了解设计试验方法的思路及全过程 1 了解放射免疫分析系统中抗体滴度选择的方法，设计确定抗体滴度方法的实验 2 掌握倍比稀释的操作步骤 3 实验原理 实验原理 浓缩抗血清用适当缓冲液稀后，与定量的标记抗原反应至平衡，分离结合部分， 测不同稀释度抗体与标记抗原结合率。 B/T=30-50%的抗体滴度为应用抗体滴度。 实验试剂 实验试剂 浓缩抗体 125I-Ab BSA缓冲液 免疫分离剂 T4Ab T4Ag* 实验步骤 实验步骤 1 从第2管起每管加100ul缓冲液 2 1号管家100ul抗体，2号管加入100ul抗体混匀 3 从2号管中取出100ul加入3号管，混匀后再取出100ul加到4号管，依此类推。 实验步骤 实验步骤 4 每管加入100ul的Ag*混匀 5 在离心之前，取一管测总T 6 37度水浴1小时，向各管中加入1000ul分离剂，3000转/分钟，分离15-20分钟 实验步骤 7 测各管的cpm值 实验结果 实验结果 实验结果图 如图所示：B/T在30%~50%的相应抗体稀释度为1：2~1：4 注意事项 1、加量要准确。 2、用过的吸头不要互相污染。 3、离心时间要充足，离心前要加分离剂 4、接触标记物的器皿要单独处理，防止放射性污染。 二、碘化标记物游离碘鉴定方法 实验目的 根据评价标记抗原质量的标准设计鉴定标记抗原方法的实验 1 通过本次实验了解为实现某一目的而设计实验方法的思路及全过程 ２ 实验原理 浓缩抗血清用适当缓冲液稀释后，与定量的标记抗原反应至平衡，分离结合部分，测不同稀释度抗体与标记抗原结合率。B/T=30-50%的抗体滴度为应用抗体滴度。 实验试剂 实验试剂 1%BSA磷酸盐缓冲液 10%三氯乙酸溶液 125I标记物 实验步骤 1 取测量试管一只加入100ul125I标记物，加入缓冲液0.5ml，测量其总放射性。 2 向上述溶液加入10%三氯乙酸10ml，混合后，在300r/min条件下，离心10min. 3 从2号管中取出100ul加入3号管