第二章 核酸化学3.ppt

2、核酸的纯度要求 ① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； ③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 3、核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； ② 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行； ③ 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； ④ 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。 二、核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解 核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 三、核酸的测定方法 1、紫外吸收法 2、 定糖法 3、 定磷法 四、核酸序列测定 DNA的一级结构的测定方法 1.Sanger双脱氧链终止法(酶法测序） DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3′末端，添加双脱氧的NTP(核苷酸链合成抑制剂）,依据碱基配对的原则，通过生成新的3′,5′－磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。 具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示： 2. MaxamGilbert DNA 化学降解法 (1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P； (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰； (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开； (5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列,如下图所示： * 1、与蛋白质相似，酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性基团碱基，因而酸也具有两性性质。 2、由于酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所酸的等电点比较低。（当酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时酸溶液的pH值即为酸的等电点pI）如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。酸在其等电点时溶解度最小。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。 DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀酸） DNA和RNA在细胞中常以蛋白形式存在，两种蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 DNA蛋白 RNA蛋白 0.14mol/LNaCl - + 1-2mol/LNaCl + - DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。酸发生变性或降解后其粘度降低。 酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与酸的大小和密度有关。 DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成蛋白，二种蛋白在盐溶液中溶解度不同，DNA蛋白难溶于0.14mol/l的NaCI溶液，可溶于高浓度（1—2mol/l)的NaCI溶液， 而RNA蛋白难溶于0.14mol/l的NaCI溶液，因此常用不同浓度的盐溶液来分离二种蛋白。 一、性状和溶解度 1.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，均微溶于水，不溶于有机溶剂。 2.DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。 3.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳