第六章--荧光分光光度法.ppt

第六章 荧光分光光度法 基本要求： 了解荧光光谱法的基本原理和应用特点。了解荧光分光光度计的组成以及特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。了解影响荧光强度的因素。 第一节 概论 一、应用： 1.定量分析 能产生荧光 或能形成荧光配合物的物质。 2.简单定性 回答“是不是”。 第二节 基本原理 一、分子荧光的产生 物质吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态 释放能量⒈以热能的形式。⒉以光辐射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这种现象称为光致发光。 最常见的光致发光：荧光和磷光。 两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～10-6秒，磷光寿命10-3～10秒。 荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的原子产生，本章介绍分子荧光。 由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。 二、激发光谱和发射光谱 ⒈ 激发光谱 固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F)所作的光谱曲线。 ⒉ 发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F所作的光谱曲线。 三、分子荧光与分子结构的关系 分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。 四、荧光强度与浓度的关系 Φ：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。 I0：入射光强度 ε：摩尔吸光系数 b： 光程 c：浓度 第三节 荧光分光光度计 一、基本结构示意图 二、主要部件及功能 1．光源 高压汞蒸气灯，氙灯。 能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。 2．激发光单色器 作用：提供单波长的激发光。 色散元件：棱镜或光栅。 出射狭缝宽度可调 。 3．样品池 须用石英材料制成。 4．荧光单色器 将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧光通过。 出射狭缝宽度可调。 5．检测器 光电转换元件，测定荧光的强度。 检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的干扰。 由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。 第四节 定量分析 一、定量方法 一般采用工作直线法。作C—F直线。 二、影响荧光强度测定的因素 1．激发光照射 有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F↓。 所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在 测定时才打开光闸让激发光照射样品池。 2．温度 温度↑，荧光效率下降，F↓。（因为，温度↑，增加分子间 碰撞机会而使能量消耗掉。） 4．溶剂 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。 三、定量分析的特点及应用 灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。 选择性好，与能产生荧光的物质少有关。 思考题 一、概念 （荧光）激发光谱 （荧光）发射光谱 二、问答题 试述分子荧光产生的过程。 试述分子荧光强度与浓度的关系式，并说明公式成立的前提条件及原因。 分别说明荧光分光光度计两个单色器的作用，以及将光路设计成直角方向的原因。 为什么可见光分光光度计的光路是直线方向，而荧光分光光度计的光路是直角方向？ * * 回顾： 四大类 电化学分析法 光学分析法 色谱分析法 其它分析方法 原子光谱法 分子光谱法 X射线光谱法 核磁波谱法 紫外-可见光分光光度法 荧光分光光度法 红外吸收光谱法 拉曼光谱法 二、特点： 灵敏度高，比吸收光谱法高103~104倍。ppb 选择性比吸收光谱法好。 荧光 磷光 无辐射跃迁 激发态 亚稳态（三重态） 基态 300 350 400 λ(nm) F 【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。 300 350 400 λ(nm) F 【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。 能产生荧光的分子具有的结构特点： 共轭双键 刚性平面 多环结构 【例】 芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。 F=2.303ΦI0εbc 公式成立前提条件：εbc=A0.05 即：当试样浓度较低时（c0.05/εb），C与F方成线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生无辐射去激活，造成线性偏离。） 特点：1 ．光源方向与检测方向成直角； 2 ．二个单色器。 · 显示器 检测器 荧光单色器 样品池 激发光单色器 光源 F C ⑴配制一系列待测成分的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5 ⑵测出