聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法..doc

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法 (一)管型盘状电泳 1.仪器和设备 图8 管型盘状电泳槽结构 A为正面 B为剖面 (1)?? 分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7 (3)电极缓冲液PH8.3 ? ? ? 电泳槽：盘状电泳槽国内有很多单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。 电泳仪：国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ型，电压在0～600v内任意调节，电流输出0～100mA，这类电泳仪比较恰当。 玻璃管：选择粗细均一的圆玻璃管，内径5～7mm左右，管长70～100mm。管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。 聚胶架：普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。 微量注射器或微量进样器：加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用25.50或100μl的微量进样器加样，也可用50或100μl加液器代用。 普通注射器：主要用于灌胶和剥胶，20～30ml，附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。 其他：日光台灯，PH计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平等。 2.试剂 甲叉双丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵；核黄素(VB2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；盐酸等。 丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。 (1)丙烯酰胺纯化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃)，热滤，滤液凉后置-20℃冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。 (2)甲叉双丙烯酰胺纯化法：12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml 40～50℃丙酮，加热过滤，滤液置-20℃冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备用。 3.试剂配制 (1)凝胶及缓冲液配制系统 有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。列表4供参考。最常用的是系统1(所谓Davis的标准状态)。各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。用时需测PH值，以检查是否失效。TEMED要密封贮藏。过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。 表4 几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统 DIV align=center 系统Ⅰ (PH值8.9)(7.2%) 系统Ⅱ (PH值7.5)(7.5%) 系统Ⅲ (PH值4.3)(15%) 系统Ⅳ (PH值2.9)(7.5%) 溶液号 组份/100 ml PH 值 溶液号 组份/100ml PH值 溶液号 组份/100ml PH值 溶液号 组份/100ml PH值 1 1mol/l HCl 48.0ml Tris 36.3克 TEMED 0.46ml 8.9 15 1mo;/L HCl 48.0ml Tris 6.85克 TEMED 0.46ml 7.5 17 1mol/L KOH 48.0ml 醋酸17.2 mlTEMED 4.0ml 4.3 20 1mol/l KOH 12.0ml 醋酸.25ml TEMED 1.15ml 2.9 2a 丙烯酰胺 28.0克 双丙烯酰胺0.735克 8 2 丙烯酰胺 30.0克 双丙烯酰胺0.8克 6 8 丙烯酰胺 60.0克 双丙烯酰胺0.4克 ? 21 过硫酸铵 2.8克 ? 3 过硫酸铵 0.14克 ? 16 1N H3PO4 39.0ml Tris 4.95克TEMED 0.46ml 5.5 18 过硫酸铵 0.28克 ? 22 1N KOH 48.0升 醋酸2.95ml 5.9 4a 1N HCl 48ml Tris 5.98克 TEMED 0.46ml 6.7 ? ? ? 19 1N KOH 48.0ml 醋酸2.87ml TEMED 0.46ml 6.7 ? ? ? 5 丙烯酰胺 10.0克 双丙烯酰胺2.5克 6.7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 核黄素 4.0mg ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 7 蔗糖 40.0克 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 电极缓冲液： Tris 6.0克 甘氨酸 28.8克 加水至 1升 使用：10%稀释液 8.3 电极缓冲液： 二乙基巴比妥 5.82克 Tris 1.0克 加水至 1升 7.0 电极缓冲液： β-丙氨酸 32.2克 醋酸 8.0克 加水至1升 使用