蛋白质组样品制备程序..doc

蛋白质组样品制备程序 一、样品制备试剂的准备 二、细菌细胞样品的裂解处理步骤 三、人培养细胞样品的裂解处理步骤 四、膜蛋白裂解方法步骤 一、样品制备试剂的准备 裂解缓冲液储备液的准备 下述本样品制备方法已经过优化, 并被证明配合使用PF-2D 试剂盒可获得最佳的结果。您若选择其他的样品处理和细胞裂解方法，请务必避免使用离子型的表面活性剂、磺酸盐或者其它钠盐成份。建议也不能使用Triton X-100。 1）裂解缓冲液储备液中试剂组份的浓度： 尿素 (urea) (Sigma P/N: U0631) 7.5M 硫脲 （thiourea）(Sigma P/N:T7875) 2.5M 甘油（glycerol）(Sigma P/N:G6279) 12.5% Tris (Fisher, p/n: BP154-1,分子生物级) 50mM n-辛基葡糖苷 (n-octylgucoside)（Sigma P/N: O8001） 2.5%(用量很大) TCEP (Tris-(carboxyethyl)phosphine hydrochloride) (Sigma P/N: C4706) 6.25 mM 蛋白酶抑制剂 (Protease inhibitor cocktail in water for general use to inhibit the activity of serine, cycteine,aspartic, and metalloproteases) (Sigma P/N:P2714) 1.25mM 2) 12.5%甘油溶液（50mL）的配制 量取6.25mL甘油到50mL的量筒； 加蒸馏水至指定刻度（50mL）。 3）31.45mM蛋白酶抑制剂溶液（10mL）的配置 在P/N P2714蛋白酶抑制剂中加入10.0 mL的水，混匀。 分装到2mL的小瓶中，放置在-20℃保存备用。 4）裂解缓冲液储备液（50mL）的配制 A、称取以下个化合物组份放置在100mL的烧杯中 尿素 22.52克 硫脲 9.52克 Tris 0.304克 n-辛基葡糖苷 1.25克 TCEP 0.0896克 B、量取12.5% 的甘油溶液20mL和取31.45mM蛋白酶抑制剂溶液2.0mL, 加到上述烧杯中，充分搅拌，至完全溶解。 把溶液转移到50mL的量筒（量杯中）。 添加12.5%的甘油溶液，至50mL。 分装以上的缓冲溶液储备液到小瓶中，每瓶2.0mL, -20℃条件保存备用。 二、细菌细胞样品的裂解处理步骤 细胞的破碎： 1）将沉淀的细菌细胞悬浮在0.4mL的50mM Tris（用10%的HCl调节pH值 到7.8-8.2）中, 剧烈振荡（Votex rigorously）充分混合，然后在冰浴 中用超声波破碎仪（微型超声探头）破碎处理，重复两次，每次30 秒。此过程用于破碎细胞膜。后加入1.6mL的裂解缓冲液储备液，充分混合。 若沉淀的细菌细胞量较大（总体积超过0.1mL）不易于悬浮在0.4mL的 50mM Tris溶液中, 则将0.4mL的50mM Tris溶液(用10%的HCl调节pH 值到7.8-8.2)与1.6mL的裂解缓冲液储备液预混合, 后用于悬浮细菌细 胞沉淀物。剧烈振荡后，与上述同样超声破碎处理。 上述所获最后细胞裂解液的组份是：6M的尿素、2M的硫脲、10% 的甘油、50mM 的Tris、2%的n-辛基葡糖苷、5 mM TCEP和1mM蛋 白酶抑制剂。 2） 在4℃条件下以20000g的离心力冷冻离心60分钟 （离心力务 必达到或大于20000g）。mL，充分混合。 2）用约25mL初始缓冲液平衡PD-10柱（编号：17-0851-01）。 3）加入第1）步骤获得的2.5mL样品到PD-10柱, 丢弃洗脱液。 4）用初始缓冲液洗脱, 从PD-10柱中洗脱蛋白质, 收集前3.5mL部分。 5）所获得的3.5mL样品即可用于HPCF 1D柱的进样分离分析。 * 为检验所获得样品的优劣，可取50uL上述已经交换过的样品进样到HPRP 2D柱，观察所有蛋白的反相分离图谱。在这一步,如果样品制备有一些问题,在分析该色谱图后将会鉴别出来。注意:根据化合物和蛋白的量预测样品, 在这时应该得到一张“豪猪”状的色谱图(a very spikey or porcupine liking chromatogram)，使你分析的样品有意义,如果没有这样的蛋白图谱, 请停止进行色谱聚焦分离分析步骤，继续摸索样品制备的过程和步骤。 三、人培养细胞样品的裂解处理步骤 1、细胞的破碎： 1）将0.4mL的