资料-多糖含量测定的各种方法优缺点.doc

苯酚-硫酸法测多糖含量 一、原理 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。试剂 　　1浓硫酸：分析纯，95.5% 　　280%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 　　36%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 　　4标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。 　　515%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 　　65%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 　　76mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 86mol/L 盐酸操作 　　1制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 　　2样品含量测定 　　取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 　　离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。　　水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96水浴锅中水浴2小时。 　　定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。注意 此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。 对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.10.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定即可无碍。(?g)为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。? 2、样品的测定? 将样品溶液糖浓度调整到测定范围，精确吸取2mL置于干燥洁净试管中，在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min，每个浓度做2~3个重复。? 在625nm波长下迅速测定各管吸光值。根据葡萄糖含量的标准曲线，由样品溶液吸光值计算各样品溶液中糖的浓度，并计算其糖含量。? 四、注意事项? 该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。? 在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。? 不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。 多糖含量的测定 一、原理 分子量大于10,000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。 二、适用范围 参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10,000道尔顿葡聚糖的样品。 三、仪器 1、分光光度计 2、离心机 3、旋转混匀器 4、恒温水浴锅 四、试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 1、80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。 2、2.5mol/L NaOH溶液：100gNaO