第六克隆基因的表达.ppt

Thank you Gene engineering 一、遗传检测法 遗传检测法可分为根据载体表型特征和根据插入序列的表型特征选择重组子两种方法。 1．根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 在基因工程中使用的所有的载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。质粒以及柯斯载体具有抗药性标记或营养标记，而对于噬菌体来说，噬菌斑的形成则是它们的自我选择特征。 (1) 抗药性标记插入失活选择法 pBR322质粒是DNA分子克隆中最常用的一种载体分子。编码有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。只要将转化的细胞培养在含有四环素或氨苄青霉素的生长培养基中，便可以容易地检测出获得了此种质粒的转化子细胞。 重组菌 非重组菌 非重组菌 不含有抗菌素的 培养基 含有抗菌素的 培养基 含有抗菌素的 培养基 (2) β—半乳糖苷酶显色反应选择法 外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成的β-半乳糖苷酶失活效应，可以通过大肠杆菌转化子菌落在X-gal-IPTG培养基中的颜色变化直接观察出来。在pUC质粒载体lacZ序列中，含有一系列不同限制酶的单一识别位点，其中任何一个位点插入了外源克隆DNA片段，都会阻断读码结构，使其编码的肽失去活性，结果产生出白色的菌落。 2．根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 这种选择法依据的基本原理是，转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。例如，编码大肠杆菌生物合成基因的克隆所具有的外源DNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株的不可逆的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性，便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。 二、物理检测法 这类重组体质粒，只要根据其相对分子质量比野生型大这一特点，就可以检测出来。常用的重组体分子的物理检测法有凝胶电泳检测法和R—环检测法两种。 1．凝胶电泳检测法 带有插入片段的重组体在相对分子质量上会有所增加。分离质粒DNA并测定其分子长度是一种直截了当的方法。通常用比较简单的凝胶电泳进行检测。 2.小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析 * * 第二节 外源基因 在真核细胞中的表达 一、 真核细胞基因克隆载体 1．在酵母细胞中克隆基因常用的载体 酵母是研究真核生物DNA的复制、重组、基因表达以及调控过程等的理想材料，为此，也构建了许多人工质粒载体。 根据这些质粒和复制方式不同，把它们分为整合型(YIp)、复制型(YRp)、附加体型(YEp)等。 以上3种类型载体的共同特点是： ① 能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增； ② 含有在酵母细胞中便于选择的遗传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补。有些还携带有用于大肠杆菌的抗生素抗性标记； ③ 含有合适的限制酶切割位点，以便外源基因的插入。 (1) 整合型载体(YIp) YIp型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的，如PYeleul0是由Co1E1质粒和酵母DNA提供的亮氨酸(Leu2+)片段构成。由于leu 2+基因片段不含自主复制起始区，只作为选择标记，所以YIp型载体在酵母细胞中不能自主复制。YIp型载体可经转化作用导入受体细胞，进入细胞后的YIp质粒DNA通过与受体染色体DNA的同源重组，被整合到染色体上，并随染色体一起复制。这样质粒DNA以单拷贝基因形式稳定地遗传。 (2)复制型载体(YRp) YRp型载体是酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。其中酵母DNA片段不但提供了选择标记，还携带来自酵母染色体DNA的自主复制顺序(ARS)。 因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体(shuttle vector)。穿梭载体在基因工程中广泛使用。 (3) 附加体型载体(YEp) YEp型载体一般由大肠杆菌质粒、2um质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2um质粒是酿酒酵母含有一个长度为2um的内源质粒，它的DNA分子通常与蛋白质结合构成复合物，存在于核区。2um质粒含有自主复制起始区(ori)和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2um质粒，人们已经构建出许多YEp型载体。 2．植物基因克隆的载体——Ti质粒 Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌