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第九章 DNA序列分析 Sequencing and Analysing of DNA DNA 的序列分析有两种基本方法， Maxam-Gilbert 化学降解法和 Sanger 氏酶学法。 因为测序每个反应读取的序列是有限的，做长片段 DNA 或基因组测序时，需要选用一定的策略。 测序的策略有 primer walking ，随机测序，定向测序等。现在全自动测序仍然沿用 Sanger 氏酶学法，但是在标记上作了改进。 DNA 测序结果通过生物信息学分析，获取需要的信息。 一、Maxam-Gilbert化学降解法 特点：特定化学试剂修饰不同碱基，并在相应碱基出切断DNA片段再进行系列分析 原理：将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。 作为标记用的放射性同位素主要有γ-32Ｐ（[γ-32Ｐ]ATP，[γ-32Ｐ]GTP. [γ-32Ｐ]TTP ，或[γ-32Ｐ]CTP），或 [γ-33Ｐ]NTP Maxam-Gilbert化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的DNA片段可以直接测序； 化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量较高的DNA片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。 自建立以来没有大的改进，操作繁琐，化学试剂的毒性大； 放射性同位素标记效率偏低，需要较长的放射自显影曝光时间，人工读取费时费力； 目前仅用于分析特殊DNA链的核苷酸序列及DNA和蛋白质互作中的DNA一级结构。 二、Sanger双脱氧链终止法 原理：双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的 3位置的-OH 缺失。当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在 DNA 多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与 DNA 合成，以其 5位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的 3位置的-OH 结合，但是，由于它自身 3位置-OH 的缺失，至使下位核苷酸的 5-磷酸基无法与之结合。 基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于1977年建立了以双脱氧链终止法为基础来测定DNA序列的方法。 以待测单链或双链DNA为模板，使用能与DNA模板结合的一段寡核苷酸为引物，在DNA多聚酶的催化作用下合成新的DNA链。 反应体系中加入了一种放射性同位素32P或35S标记的双脱氧核苷酸（*-ddATP或*-ddCTP或*-ddGTP或*-ddTTP）后，在DNA合成过程中，标记的*-ddNTP （例如*-ddATP）将与相应的dNTP（例如dATP）竞争掺入到新合成的DNA互补链中。 如果是dNTP掺入其中，DNA互补链则将继续延伸下去；如果是*ddNTP掺入其中，DNA互补链的合成则到此终止。而双脱氧核苷酸的掺入是随机的，故各个新生DNA片段的长度互不相同。 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将混合产物中不同长度DNA片段分离开，再通过放射自显影曝光，根据片段尾部的双脱氧核苷酸读出该DNA的碱基排列顺序。 三、DNA测序的基本策略 1、DNA 片段序列分析的策略 Primer walking 随机测序（random approach），或称作鸟枪法（shotgun strategy） 定向测序 引物步移（Primer walking） 原理：从目的片段的一端开始，利用载体上的序列为依据，设计第一次反应的反应引物进行测序，然后，依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，递进测序，直至完成。 该法需要多次设计和合成引物，比较繁琐；对于重复序列较多的目的DNA，由于引物的非特异性结合概率高，所以该方法不适合于测定含有多重复序列的DNA片段。 随机测序（random approach），鸟枪法（shotgun strategy） 原理：将待测 DNA 克隆于噬菌体载体（M13）上，然后通过一定手段将待测 DNA 片断化（DNA 片断化的手段通常有超声波处理和酶切），得到两端彼此重叠的部位不同的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。 定向测序 基本策略：沿着目的 DNA 的同一个方向逐渐向前推进，直至目的 DNA 的另一端。可采用嵌套缺失法或引物步移法。 嵌套缺失法是利用缺失随机突变原理： 先将目的DNA克隆到载体上； 再用限制性内切酶在邻近其一端处切断载体，使之变成3端凹进5端突出的线状DNA； 再用外切酶（exonuclease Ⅲ）或者DNaseⅠ 加Mn++离子，沿此末端逐步消化目的DNA，于是只要控制消化时间，即可得到一组依次相差若干碱