第十一动物细胞培养与表达制备药用蛋白.ppt

动物细胞培养与表达制备药用蛋白 第十一章 主要内容 细胞概述……了解 动物细胞的形态和生理特性 ……熟悉 生产用动物细胞的要求和获得 ……掌握 动物细胞的培养条件和培养基 ……掌握 动物细胞培养的基本方法 动物细胞大量培养的方法和操作方式 动物细胞生物反应器 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 动物细胞产品的制造实例 动物细胞制药的前景与展望 一、细胞概述 历史与现状 细胞在生物制药中的意义 原核细胞与真核细胞区别 第二节 动物细胞的形态与生理特性 1. 贴壁细胞的生长特征 2. 悬浮细胞的生长特征 3. 兼性贴壁细胞 动物细胞的化学组成与代谢 大分子： 蛋白质 核酸 糖 脂质 大分子代谢的三个阶段 产能代谢：三羧酸循环 葡萄糖产能对比 供氧不足：糖酵解途径 2 ATP; 供氧充分：三羧酸循环 36～38 ATP； 动物细胞大规模培养：供氧成为生物反应器设计的最重要的因素之一！ 动物细胞的生理特点 细胞的分裂周期长：12～18h 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象； 正常二倍体细胞的生长寿命有限； 动物细胞对周围环境敏感； 动物细胞对培养基的要求高； 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。 各类细胞周期时间表 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象：在玻璃、塑料等基质上生长，与电荷、钙镁离子、贴附因子（collagen， Fibronectin）有关。 无血清培养基：少！ 正常二倍体细胞的寿命有限 原代培养：离体培养开始的时间称“原代培养”；经若干代之后细胞趋于死亡。成纤维细胞～50代，加入表皮生长因子～150代。转化成异常体后～无限细胞系，成为“永生化”细胞。 动物细胞对周围环境十分敏感 细胞膜对理化因素：渗透压，pH, 离子浓度，剪切力，微量元素等敏感。一切导致脂质和蛋白质变性的因素都影响动物细胞的存活 动物细胞对培养基的要求高 原核细胞：碳源：葡萄糖，麦芽糖，淀粉，氮源：蛋白胨，玉米浆，酵母粉；无机盐：PO4,, Na, K+, Fe++, 动物细胞：营养要求高！12种必需氨基酸，8种以上维生素，多种无机盐，微量元素，碳源：葡萄糖，多种细胞因子，贴壁因子，血清。 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 既在游离核糖体（细胞质基质蛋白）上合成， 更多的在粗面内质网（分泌蛋白，整合蛋白， N-linked glycoprotein）上进行。多数为糖蛋白。,高尔基体（O-linked glycoprotein）。 蛋白质的糖基化与细胞功能密切相关：细胞识别，胞内消化，外排分泌物。 因此，有些生物药品不能用原核细胞表达：EPO 第三节 生产用动物细胞的要求和获得 一、生产用动物细胞的要求： 正常组织的原代细胞：鸡胚、兔肾细胞等 多次传代的二倍体细胞：WI-38, 2BS，Namalwa细胞：干扰素 Vero细胞：狂犬病疫苗、脊髓灰质炎症疫苗 杂交瘤细胞：OKT-3 mAb 逐步取消了非二倍体细胞的限制 DNA残留量的检测！ 二、生产用动物细胞的获得 原代细胞 二倍体细胞 转化细胞系 融合细胞系 重组工程细胞系 原代细胞 最无争议的细胞，但费时，费力，成本高，如：鸡胚细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，淋巴细胞等； 2. 二倍体细胞： 原代细胞的驯化产物，仍具正常细胞的特点：2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限增殖（50代以内），无致瘤性。代表性细胞株：WI－38， MRC-5，2BS； 3. 转化细胞系： 正常细胞的自发转化，人为转化（SV40，甲基胆蒽） SV40，即猿猴空泡病毒40（Simian vacuolating virus 40），是一种多瘤病毒，也是一种DNA病毒，有造成肿瘤发生的潜在能力。 代表细胞株：Namalwa, CHO, BHK-21, Vero 4. 融合细胞系： 两个或两个以上细胞融合而成。——受精。 动物－动物细胞，动物－植物细胞； 诱导物： （1）仙台病毒： 副流感病毒I型。方法：4oC 聚集，37 oC反应，细胞穿通，细胞融合。以经很少使用。 （2）聚乙二醇PEG: 分子量1000， 浓度50％，Ph8.0~8.2,融合率近100％。单抗生产中使用。 （3）电融合：电场0.5～1.5V，脉冲1～50μs。 5. 基因工程技术构建重组工程细胞 （1）真核细胞基因表达载体的构建 I、病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、杆状病毒 II、非病毒载体：质粒 （2) 基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 融合法：脂质体 化学法：磷酸钙沉淀 物理法：电转、基因枪 病毒法：DNA病毒、RNA病毒、多瘤病毒 五、细胞库的建立 原始细胞库：master cell bank, MCB 生产细胞库: manufacturer