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甲醛固定的不同组织中DNA提取的比较 　　[摘要] 目的 研究运用改良酚-氯仿法从甲醛固定组织中提取DNA的方法，对比心、肝、肺、脑4种脏器DNA提取质量的优劣，从而了解哪种经甲醛固定后的组织易于得到质量较为可靠的DNA，以达到对DNA扩增及后续研究的目的。方法 选取甲醛固定标本脏器各14例，以蛋白酶K消化和酚-氯仿法提取检材中DNA，对所得DNA质量以紫外分光光度计、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析进行结果判断。结果 心、肝、肺、脑4种组织所提DNA的OD260/OD280比值分别为（1.842±0.380）、（1.861±0.076）、（1.387±0.113）、（1.428±0.087）。每100毫克组织中DNA含量（μg）分别为（0.944±0.530）、（1.096±0.544）、（0.348±0.273）、（0.601±0.238）。PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳分析显示，心肌和肝脏组织的条带清晰度高于肺脏和脑组织。结论 经甲醛浸泡固定的心肌组织和肝脏组织，运用改良酚-氯仿法所得DNA质量较为可靠，可以用于后续研究。 　　[关键词] 法医病理学；甲醛固定；改良酚-氯仿法；DNA提取 　　[中图分类号] R91 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）07（b）-0116-03 　　检材中DNA的提取是法医学中常用的一项技术，同时也是分子生物学中研究基因功能的重要步骤[1]。目前，从新鲜组织中提取高质量DNA的技术已经比较成熟，但由于某些疾病的新鲜标本获取较为困难，使通过新鲜组织进行DNA水平的研究相对受限。在国内，几乎所有的医院及司法鉴定机构等都存在大量的经甲醛直接浸泡固定的组织，其获取和保存较容易[2-3]，然而这些组织中的DNA因甲醛的影响降解相对严重，从中提取高质量的DNA非常困难，能否成功提取这些组织的DNA往往在医疗纠纷及刑事案件中起着举足轻重的作用。在前期研究中本研究发现通过改良酚-氯仿法较其他方法更容易从甲醛固定组织中提取出DNA，使得从组织中提取DNA开辟了一条新的途径[4]，不过此提取方法在不同脏器组织所得DNA 的质量及效率上是否存在差异，其相关研究报道较少。本实验采用改良蛋白酶K消化和酚-氯仿法提取经甲醛固定的心、肝、肺、脑四种常见脏器的DNA，并对其结果进行分析，以期发现使用经甲醛浸泡固定的何种脏器更易于得到质量较为可靠的DNA以用于后续研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　搜集2009～2012年山西医科大学司法鉴定中心经10%甲醛固定的标本14例，每例分别取心、肝、肺、脑4种组织，共56例样本，均按同一种方法进行DNA提取。 　　1.2 方法 　　从甲醛固定的每例样本中切取100 mg，用蒸馏水冲洗后在干燥研钵内碾磨碎，再用2×蔗糖-Triton洗涤，1000 r/min离心15 min，弃去上清液，沉淀用3 ml TE 缓冲液（pH 9.0）打匀，加SDS 1 ml，加蛋白酶K，在48℃水浴摇床中保温48 h。取上清液，依次用等体积苯酚、氯仿，苯酚/氯仿（1∶1）在4℃条件下14 000 r/min离心10 min，重复2遍。取上清液，加入预冷2倍体积的无水乙醇以及1/10体积的3mol/L NaAc，颠倒混匀置于-20℃环境下30 min。4℃条件下14 000 r/min离心10 min。弃去上清液，得到DNA沉淀，用70%乙醇洗涤2遍，14 000 r/min离心5 min，自然干燥沉淀。加TE（pH 8.0）在4℃条件下过夜。-20℃保存备用。 　　1.3 DNA的测定 　　1.3.1 测定DNA的浓度 将上述方法提取的DNA样品经紫外分光光度计于260 nm和280 nm处分别读取其吸光度（A）值，DNA的纯度可根据OD260/OD280比值计算。 　　1.3.2 PCR的扩增 PCR反应体系为20 μl，其中Premix Taq 10 μl，DNA模板与去离子水混合体系8 μl，引物（GAPDH，上游：5-CAACAGCGACACCCACTCCT-3，下游：5-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3）2 μl。PCR反应条件：98℃条件下变性10 s，60℃条件下退火30 s，72℃条件下延伸60 s，循环次数为30次。 　　1.3.3 琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis，AGE）试验 取扩增产物9 μl，加入PBE缓冲液 1 μl及Maker 6 μl同时上样，经3.0%的AGE（100 V，40 min），在紫外凝胶成像系统下观察所得DNA的PCR扩增结果。 　　2 结果 　　2.1 4种组织所提取DNA的OD260/OD280值及其质量的比较 　　在DN