电针联合BMSCs移植治疗对出血性脑卒中大鼠血清BMP表达的影响.docVIP

电针联合BMSCs移植治疗对出血性脑卒中大鼠血清BMP表达的影响 　　【摘要】 目的：探讨电针联合骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植治疗对出血性脑卒中大鼠血清髓鞘碱性蛋白（MBP）表达的影响。方法：将培养的BMSCs和生理盐水分别移植入脑出血模型大鼠尾壳核内，将NSS评分≥9分的模型大鼠随机分为4个实验组：生理盐水组（NS组）；电针组（Ea组）；BMSCs移植组（BMSCs组）；电针联合BMSCs移植组（Ea BMSCs组），每组25只。另选正常对照组（Normal组）5只，不做任何处理；假手术组（FO组）5只，造模和移植都同步麻醉和进针但不注入任何药物。用MK3全自动酶标仪对血清中MBP进行ELISA检测。结果：脑出血各治疗组MBP第1天表达最高，随即下降第3天达谷底，随后快速上升第7天达到波峰后下降，但都高于FO组和Normal组（P0.05）。与NS组比较：Ea组第5、7、14天MBP表达低于NS组（P0.05）；BMSCs组MBP表达第14天低于NS组（P0.05）；Ea BMSCs组第5、7、14天MBP表达显著低于NS组（P0.01）。与Ea BMSCs组比较：Ea组第1、3天MBP表达低于Ea BMSCs组（P0.05），第14天高于Ea BMSCs组（P0.05）；BMSCs组MBP表达第5、7、14天高于Ea BMSCs组（P0.05）。结论：电针联合BMSCs移植治疗脑出血能有效保护神经组织减轻脱髓鞘反应，降低MBP的表达。 　　【关键词】 电针； 骨髓间充质干细胞； 移植； 脑出血； 髓鞘碱性蛋白 　　研究表明将骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）移植入脑出血大鼠，BMSCs能存活、迁徙、分化为神经元和胶质细胞，减少损伤体积，促进神经功能的恢复[1-2]。临床实践与动物实验表明电针对脑出血运动功能恢复具有明显促进作用[3]，但对其机制的研究还不够深入。髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein，MBP）是构成中枢神经系统髓鞘的一种碱性蛋白，神经组织损伤时髓鞘崩解，MBP从神经纤维髓鞘上脱落，MBP含量较正常生理状态下急剧增高，其血清含量的增高是急性脑实质损伤和脱髓鞘改变的特异性生化指标[4]。本研究旨在探讨电针联合BMSCs移植治疗对脑出血大鼠血清MBP表达的影响，为电针联合BMSCs移植治疗脑出血的神经保护机制提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物、试剂与仪器 成年SD雄性大鼠110只，体质量200～300 g，由泸州医学院实验动物中心提供；Rat Mesenchymal Stem cell购自赛业生物科技有限公司；肝素钠注射液购自上海市医药股份有限公司；I型胶原酶购自Sigma公司；α-MEM培养基购自美国Gibco公司；MBP抗体，MBP酶标抗体，SABGCy3购自武汉博士德；HM 6805-Ⅱ型经穴治疗仪购自四川恒明科技开发有限公司；Multiskan MK3全自动酶标仪购自博奥通科科技（北京）有限公司。 　　1.2 大鼠脑出血动物模型制备 用5 ?L微量注射器抽取2 U/?L的肝素钠1 ?L和0.125 U/?L的胶原酶2 ?L，然后固定在立体定位仪上。实验大鼠用1%戊巴比妥钠按40 mg/kg的标准进行腹腔注射麻醉；然后固定于立体定位仪上，作颅顶中线切口12 mm，用30%H2O2腐蚀暴露前囟及冠状缝，以前囟为基点，向前0.2 mm，向右3 mm，开颅钻钻孔至硬脑膜，沿钻孔进针6 mm，将肝素钠和胶原酶溶液缓慢注入尾壳核内，留针5 min，缓慢退针，速度为1 mm/min，骨蜡封闭钻孔，消毒缝合切口。 　　1.3 BMSCs复苏、培养、传代及诱导 在超净工作台内打开冻存管，将解冻后的细胞转入离心管中加入10倍体积的改良型α-MEM培养基，吸管轻吹均匀。1000 rpm离心4 min。弃上清，加入含15%胎牛血清的的α-MEM培养基，调整细胞密度以5×105/mL[5]。转入25 mm2培养瓶置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养，当细胞生长铺满培养瓶壁75%～80%左右时传代。细胞移植前，将贴壁达80%融合BMSCs的培养基，更换为预诱导液培养24 h，再更换为诱导液诱导6 h后，收集细胞，调整细胞密度以2.5×107/mL，置于培养基中备用。 　　1.4 BMSCs移植及电针治疗 在造模成功后第3天，用脑立体定位仪进行固定，取细胞悬液20 ?L沿造模孔缓慢注入尾壳核，速度为5 ?L/min，留针5 min，缓慢退针，骨蜡封闭钻孔，消毒缝合切口。在造模成功后第3天，对大鼠捆绑固定，参照林文注等[6]编著的《实验针灸学》，应用30号l寸毫针，选取百会穴及大椎穴进针，毫针接HM 6805-Ⅱ型经穴治疗仪