结肠癌组织中端粒酶检测及血清CEA检测的临床意义.docVIP

结肠癌组织中端粒酶检测及血清CEA检测的临床意义 　　【摘 要】结肠癌是消化道肿瘤中发病率较高的恶性癌肿，早期发现、早期手术是延长生命、提高生活质量的关键。研究发现端粒酶（Telomerase）活性的检测对结肠癌早期诊断是非常有价值，血清癌胚抗原（CEA）检测对结肠癌早期诊断亦有辅助作用。本文通过对50例结肠癌组织中的端粒酶活性及血清CEA的检测，探讨它们在结肠癌诊断中的价值。 　　【中图分类号】R44 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）09―0756―02 　　1 料和方法 　　1.1 临床资料 　　1.1.1 病例来源： 治疗组取自2010年1月-2012年10月吉林大学第一医院普外科结肠癌根治术的病人50例，男30例，女20例，平均年龄56.5±16.5岁。对照组为本院门诊镜检科行结肠镜检查的病人50例，诊断均为肠良性息肉，年龄与治疗组无显著差异。标本均于- 80℃液氮中保存备端粒酶活性检测。 　　1.1.2 病理类型及分期：50例结肠癌患者中： 腺癌22例，粘液癌13例，鳞状细胞癌15例；临床分期：Ⅰ期8例， Ⅱ24期例， Ⅲ期以上18例。50例门诊肠镜检查的病人肠息肉均为良性。 　　1.2 实验方法 　　端粒酶提取 取活检组织约48mg 在Ep试管中用PBS缓冲液去除污血，干净后匀浆，加入最为合适量的冷PBS于5-6℃静置片刻，取上清液180μL ，离心后收集细胞，立即加入裂解液30μL ，将其混匀，冰浴约40 min ，接着在4 ℃以14500 r/ min 离心9 min ，取上清液在- 20 ℃保存。 　　端粒酶活性检测 以PCR - TRAP 法检测端粒酶活性，其反应混合液中含18μL Tris - HCL （pH 7.9） ，1mmol/ L MgCl2 ，58 mmol/ L KCl ，0.01 % Tween 18 ，1.2 mmol/ LEGTA ，48 mmol/ LdNTP ，2μg T3 基因29 蛋白，BSA 0.12μg/ mL ，α-29p- dCTP 7.2 kBq ， Taq DNA 聚合酶3IU ， TS 引物0.22μg和蛋白提取物7μg ，高压后去离子水，至终体积30μL 。使其混匀，上层以石蜡油盖之，于37℃保温32 min。88℃3 min 灭活端粒酶，加CX引物0.009μg 行PCR 扩增，扩增条件：92℃变性3min ，94 ℃39 s ，48℃38 s ，69 ℃48s ，共32 循环；69℃延伸6min。取PCR 产物12μL ，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以X线胶片放射显影， - 79 ℃25～50 h 显示结果，出现7bp 梯形带为阳性，以7μg Hela 细胞蛋白为阳性对照。 　　1.3 血清CA19-9及CEA检测 　　血清CEA检测：取5ml外周血送中心实验室常规检测，CEA参考值为20 ng/m，如增高时提示消化道肿瘤阳性。 　　1.4 统计学方法 采用SAS 11.0 软件统计分析，组间比较用 X2 检验，P0.05有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 端粒酶、血清CEA在结肠癌及肠息肉组织中的表达 　　端粒酶、血清血清CEA阳性率在结肠癌组织与肠息肉组织中比较差异均有统计学意义（均P0.05）。结肠癌组织中端粒酶阳性率虽高于CEA，但差异无显著性（P?0.05）。见表1。 　　2.2 端粒酶、血清CEA阳性率与结肠癌临床病理特性的关系 　　结肠癌患者端粒酶及CEA阳性率在不同分化程度差异无统计学意义（P?0.05）。结肠癌患者血清CEA阳性率在Ⅲ期-Ⅳ期明显增高，与Ⅰ期、Ⅱ期比较差异显著（P0.05） 。见表2。 　　2.3 端粒酶、血清CEA在结肠癌组织中的联合表达情况 　　端粒酶、血清CEA在结肠癌组织表达呈正相关（P0.05）。50例结肠癌中共有21例端粒酶、血清CEA同时呈阳性表达，晚期结肠癌病例同时呈阳性的比率增加。 　　3 讨论 　　端粒是真核细胞染色体末端的一个像帽子一样的特殊结构，由重复DNA序列及相关蛋白质组成。端粒DNA是由5′-CCCCAA-3′六碱基重复序列构成 ， 有保护染色体的作用[1] 端粒可通过t-loop形成紧凑结构[2]，避免染色体DNA降解，避免末端融合，避免非常规重组。随着随着体细胞的不断增殖，端粒长度会逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度，细胞停止了分裂，染色体的稳定性降低，则导致细胞凋亡[3]。 　　端粒酶是一种核糖核蛋白，通过引物特异识别位点，以自身RNA为模板，在染色体末端合成端粒DNA重复序列，延长了端粒，使细胞出现无限的增殖，进而产生癌肿细胞，故对癌肿的产生起着至关重要的作用[4]。它是一种由端粒酶RNA（hTR）、端粒酶