荧光分析法2.ppt

外部能量转换 （external conversion)：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而失去能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 体系间跨越(intersystem crossing)：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。 ３.下列说法正确的是 ( ??) A? 分子的刚性平面有利于荧光的产生 B? 磷光辐射的波长比荧光短 C? 磷光比荧光的寿命短 D? 荧光猝灭是指荧光完全消失 答案：A Company Logo Company Logo 荧光分析法（fluorescence) 荧光棒发光原理 　　荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。 荧光分析法 荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光。 优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法简单。 缺点：应用范围小。 荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。 第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 基态 单重态S 三重态T E 单重态：s=0，M=1，分子所处的电子能态。 分子的多重性： 总自旋量子数： 三重态：s=1，M=3，分子所处的电子能态。 1.分子的电子能级与激发过程 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通 过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。 2.荧光的产生 传递途径 辐射跃迁 荧光 振动弛豫 无辐射跃迁 磷光 系间跨越 内转换 外转换 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ?2 T2 内转换 振动弛豫 非辐射能量传递过程 振动弛豫(vibrational relexation)：出于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子返回到同一电子能级的最低振动能级间的过程；发生振动弛豫的时间10 -12s。 内部能量转换(internal conversion)：当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ?2 T2 内转换 振动弛豫 非辐射能量传递过程 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ?2 T2 内转换 振动弛豫 辐射能量传递过程 荧光发射：激发分子从第一激发单重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为荧光；荧光辐射能要比激发能量低，荧光波长大于激发波长；荧光发射时间为10-9-10-7s。 磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ?2 T2 内转换 振动弛豫 荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统。 光源 激发单色器 样品池 发射单色器 检测器 放大器 指示器· 记录器 SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创） RF-5400荧光光度计 Hitachi(日立)F-2500荧光分光光度 荧光分光光度计澳大利亚 （二）荧光的激发光谱和发射光谱 激发光谱（excitation spectrum）：将激发光的光源用激发单色器分光，使不同波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固定波长的发射单色器而照到检测器上，测定不同波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。 注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。 荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长