红芪黄酮对肺间质纤维化模型大鼠微血管密度的影响.docVIP

红芪黄酮对肺间质纤维化模型大鼠微血管密度的影响 　　摘要：目的 观察红芪黄酮对肺间质纤维化模型大鼠微血管密度（MVD）的影响，为其开发提供实验依据。方法 SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、强的松组和红芪黄酮高、中、低剂量组，采用博莱霉素气管滴入方法建立肺纤维化模型，自造模后第2日，各治疗组分别给予相应剂量药物，按时间点连续灌胃治疗14 d和28 d，采用免疫组化法观察肺组织MVD。结果 模型组大鼠14 d肺组织内可见新生微血管显著增多，28 d有所减少。与空白组比较，模型组14、28 d MVD显著升高（P0.01）。与模型组比较，红芪黄酮高剂量组14、28 d MVD明显降低（P0.05）。红芪黄酮中剂量组表达介于高剂量组与低剂量组之间，红芪黄酮低剂量组表达与模型组相近。结论 红芪黄酮具有抑制肺纤维化大鼠微血管新生的作用，其作用与剂量相关。 　　关键词：肺纤维化；红芪黄酮；微血管密度；大鼠 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0043-03 　　对肺血管的变化与肺纤维化的形成研究较少。本实验在前期研究[1-3]的基础上，筛选红芪有效部位，探讨其在不同时间点对肺间质纤维化模型大鼠微血管密度（MVD）的影响，为其开发提供实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g，甘肃中医学院科研实验中心提供，动物质量合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0000614；动物实验设施使用证编号：SCXK（甘）2011-0001-0000362。 　　1.2 药物 　　药材选用甘肃地道药材红芪，甘肃中医学院科研实验中心药物制剂室提取、分离、鉴定（纯度50%）。注射用盐酸平阳霉素（哈尔滨博莱霉素有限公司，批号120727），醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号110810）。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　羧甲基纤维素钠（天津市大茂化学试剂厂，批号110311），戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号101021），浓缩型DAB试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司，K1266071），一抗CD34检测试剂盒（南京巴傲得生物技术有限公司，BS6481），二抗SP-9001生物素标记山羊抗兔IgG检测试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司，12122A11）。CX21型生物显微镜（日本OLYMPUS）， MiE图像处理系统（山东易创电子有限公司）；BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。 　　2 实验方法 　　2.1 分组 　　144只大鼠适应性喂养3 d，按随机数字表分为空白组、模型组、强的松组和红芪黄酮高（22.5 mg/kg）、中（15.0 mg/kg）、低（7.5 mg/kg）剂量组，每组24只，分别于第14、28日取材，每个时点12只，SPF常规饲养。 　　2.2 造模 　　适应性饲养动物3 d后，参照文献[1-3]方法复制肺纤维化模型。3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射，待大鼠夹尾无疼痛反应后，将其仰卧位固定于大鼠实验台上，剪去颈毛并常规碘伏消毒，切开颈部皮肤，逐层分离，暴露气管，用眼科弯剪经气管下方轻抬气管，用1 mL注射器经气管软骨环间隙向心端刺入，其他各组同法一次性气管内注入等体积博莱霉素生理盐水溶液5 mL/kg体质量，注入后立即将动物直立并左右旋转约1 min，使药物在肺内均匀分布。缝合切口，待动物自然清醒后，SPF常规饲养。 　　2.3 给药 　　造模后第2日起，每日上午灌胃1次，连续治疗14、28 d，持续到处死动物前1 d。红芪黄酮高、中、低剂量组分别给予22.5、15.0、7.5 mg/kg红芪黄酮，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制。强的松组给予醋酸泼尼松片，给药剂量为3 mg/kg，临用前以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制。模型组和空白组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液1 mL/100 g灌胃。 　　2.4 标本采集 　　各组大鼠于给药14 d、28 d采集标本并进行相关指标检测。末次给药后，各组大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射麻醉，剪开大鼠胸腔，小心分离肺组织，剪取右肺中叶组织制备病理切片，免疫组化法检测CD34表达。 　　2.5 电镜观察 　　CD34阳性反应物为棕色颗粒，分布在血管内皮细胞。微血管计数按Weidner方法进行：首先在低倍视野下（4物镜和10倍目镜）扫描，寻找组织内染色清晰并且微血管数目最密集的区域。然后在高倍视野下计数所有毛细血管及其小静脉的数目，任何呈棕黄色的阳性内皮细胞/内皮细胞簇只要与邻近血管、结缔组织成分清楚分开，即为一个能够计数的血管/微血管。每例标本分别记录5个400