HPLC测定马钱子及其提取物中马钱子碱和士的宁含量.doc

HPLC测定马钱子及其提取物中马钱子碱和士的宁含量 　　摘要：目的 采用反相高效液相色谱法建立同时测定马钱子药材及其总碱提取物中马钱子碱和士的宁含量的方法。方法 采用Licrospher C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈∶0.01 mol/mL庚烷磺酸钠与0.02 mol/mL磷酸二氢钾等体积混合溶液（用10%磷酸调pH值为2.8）=27∶73，检测波长260 nm，柱温30 ℃，流速为1 mL/min。结果 马钱子碱在0.1～1.0 ?g、士的宁在0.12～1.2 ?g范围内线性关系良好（r=1.000），平均回收率分别为99.88%（RSD=1.06%）、100.06%（RSD=0.78%）。结论 本方法操作可靠、精确，可用于中药马钱子药材及提取物的含量测定。 　　关键词：马钱子；马钱子碱；士的宁；含量测定；高效液相色谱法 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.019 　　中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0051-03 　　马钱子系马钱科植物马钱Strychnosenux-vomica L.或云南长籽马钱S.wallichiana Steud.ex DC.的成熟种子，有散结 　　消肿、通络止痛之功效，主要用于跌打损伤、痈疽肿痛、风湿顽痹等症[1]。马钱子主要有效成分为马钱子碱和士的宁，并含少量二者的氮氧化物。因其口服毒副反应大，尤其是士的宁，治疗剂量接近中毒剂量，通常以外用为主。因此，有必要对药材及提取物建立含量测定方法，对其质量进行控制，也为进一步以提取物制备透皮给药系统等新型制剂提供保证。本研究通过 　　对多种流动相进行比较，建立马钱子碱和士的宁高效液相色谱法（HPLC）含量测定方法，并检测不同产地3批马钱子药材与6批马钱子总碱提取物的含量，为其药材及提取物的质量控制提供依据。 　　1 仪器与试药 　　高效液相色谱仪（四元泵，美国Agilent 1100 Series，二极管阵列检测器），电子分析天平（Xs125A瑞士普利赛斯仪器公司d=0.000 1 g），RE-5210旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），DZF型真空干燥箱（北京永光明医疗仪器厂）。 　　士的宁对照品（批号110705-200306）、马钱子碱对照品（批号110706-200505），购自中国药品生物制品检定所；马钱子药材（产地广西、缅甸与四川各1批，分别购自昆明市菊花村中药材市场、西双版纳与四川成都中药材市场），经云南中医学院中药鉴定教研室杨树德教授鉴定为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子。乙腈为色谱纯（Merk公司），庚烷磺酸钠（HPLC用，Biofer公司生产，批号26547），水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。AB-8型大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）。 　　2 方法与结果 　　2.1 马钱子总碱提取物的制备 　　2.1.1 提取 将马钱子置烘箱中75 ℃干燥12 h，打成粗粉过二号筛，置于烧瓶中，分别加10、8、6倍量50%乙醇回流提取2、1.5、1 h，过滤。合并3次滤液，旋转蒸发回收乙醇至无醇味，得50%醇提物备用。 　　2.1.2 大孔树脂纯化 将50%醇提物加水至药液浓度为0.4 g/mL，用0.1%NaOH溶液调节pH至8～9，经前期试验筛选吸附树脂与洗脱条件，将马钱子提取液上AB-8型大孔树脂柱，流速1 mL/min，用3 BV水洗脱杂质、6 BV的70%乙醇洗脱总碱。合并醇洗脱液，旋转蒸发回收乙醇，真空干燥制成干浸膏。 　　2.1.3 硅胶柱分离 将经大孔树脂纯化的干浸膏用适量的甲醇-氯仿（1∶1）混合溶液溶解，加入2倍量的柱层析硅胶拌样，搅拌均匀，水浴挥干，加入100～200目硅胶柱中，用乙酸乙酯-异丙醇-浓氨水（7.5∶2.0∶0.4～7.5∶2.4∶0.6）进行梯度洗脱，150 mL/流份。经薄层色谱法检识，合并含马钱子碱和士的宁样品，回收洗脱液，65 ℃真空干燥12 h，研细，即得马钱子总碱提取物。 　　2.2 供试品溶液的制备 　　2.2.1 马钱子药材 取马钱子药材粉末（过三号筛）约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氢氧化钠试液3 mL，混匀，放置30 min，精密加三氯甲烷20 mL，密塞，称定质量，置水浴中回流提取2 h，放冷，再称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，分取三氯甲烷提取液，用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液3 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得[1]。 　　2.2.2 马钱子总碱提取物 分别精密称取6个批次的马钱子总碱粉末2