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IGFBP5在神经管发育中的表达差异 　　【摘 要】目的：探讨细胞增殖抑制因子IGFBP5在神经管发育中的作用并作初步功能分析。方法：比较胚胎9.5天、10.5天正常与同期NTD小鼠神经管组织的IGFBP5基因的表达差异，并对其进行了Northern杂交验证。结果：通过比较IGFBP5基因在正常E9.5d与E10.5d、 E9.5d- NTD、 E10.5d- NTD的表达差异，发现在正常神经胚形成前后IGFBP5表达显著上调， 在RA诱导致NTD（包括E9.5D与E10.5D两个时相）IGFBP5在RA作用后呈现下调趋势。结论：IGFBP5参与了正常神经管关闭的生理过程，在神经系统发育中的发挥重要作用，对基因的进一步研究有助于阐释NTD的发病机制。 　　【关键词】神经管 神经胚形成 基因芯片 维甲酸 IGFBP5 　　【中图分类号】R338 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0323-02 　　神经管缺陷（ neural tube defects， NTD） ， 是由于在胚胎发育过程中， 神经管闭合不全引起的一组缺陷。我国是已知世界神经管缺陷的高发国，神经管缺陷在所有出生缺陷中居首位。迄今对NTD发生的分子途径尚不了解，但对涉及此过程的基因表达与调控的研究较少[1]。实验比较了胚胎（embryonic，E）9.5天、10.5天正常与同期NTD小鼠神经管组织的IGFBP5基因表达差异，并对其进行杂交验证。以求发现此基因与NTD发生和神经胚的密切联系，并探讨其可能的分子调控途径。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物分组和NTD模型建立：清洁级成年昆明种小鼠120只，55～65日龄，体质量22～28g，无特异病原体，雌雄各半（第三军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（渝）2007003）。60对成年昆明种小鼠，于18：00按雌雄1：1合笼，次日8：00取出，检查雌鼠阴道口有无阴栓。将发现阴栓者的当日早晨8：00定为孕期第0天（E0 d）， 16：00定为E0.5 d。60只孕鼠被随机分成维甲酸组（n = 30）和正常对照组（n = 30）。根据Klootwijk 等[2]的方法制备NTD模型。将维甲酸（retinoic acid， RA）溶于玉米油内（40 g/L），按50mg/kg于孕期E7.0d～7.25d时一次性喂服孕鼠，制备NTD模型。同时正常对照组喂服等量玉米油。 　　1.2 标本采集和处理 在E9.5（n=16）、E10.5（n=12）时，处死正常及NTD孕鼠，剖腹取胎，在4倍解剖显微镜下确定已造成NTD发生，并分离胎盘、胎膜组织后，对鼠胚进行形态学辨别筛选，检查活胎数、死胎数以及每个胚胎头部、面部、脊柱、尾部等发育的外观特征，获得各阶段脑泡及脊神经组织。NTD的鉴定特征：解剖显微镜下观察典型的形态畸形包括颅脑顶部未闭呈现裂口、后脑及面部异常、脊柱或尾部有裂口及无尾或短尾等。挑选典型的异常神经管组织进行总RNA的分离和提取。 　　1.3总RNA的提取与检测 用TRIZOL试剂提取总RNA，分光光度仪检测RNA样本浓度，最后按约3.3μg/μL的浓度进行稀释分装，15μL/管（50μg），-80℃保存。每组取总RNA 20μg， 1%琼脂糖胶电泳验证其纯度。 　　1.4基因芯片杂交与扫描分析：取50 μg总RNA，反转录合成cDNA，分别用2μL Cy3-dUTP（正常对照组）或Cy5-dUTP（维甲酸组）标记cDNA。参照蒋立坚等[3]的方法，用含有1100余个已知基因的中密度芯片对每组标记的cDNA杂交。杂交后芯片用ScanAr维甲酸y 4000扫描仪扫描获取微阵列图像，扫描图像经斯坦福大学ScanAlyze2.51软件分析。反复试验3次。 　　1.5 基因表达差异的评价标准：①当2组组织中基因表达的强度比值（Cy5/Cy3）大于2.0或小于0.5时，即认为它们存在差异表达，小于0.5者为维甲酸处理后下调基因，大于2.0者为上调基因。②3次重复实验中均出现相同趋势变化。③3次实验中有2次出现相同趋势改变且第3次结果不矛盾。 　　1.6 Northern杂交：取总RNA 20μg，经甲醛变性凝胶电泳后，毛细管法标记，按QIAquick探针纯化试剂盒（Qiagen，Maryland，USA）方法进行纯化，充分洗膜后，用感光胶片进行自显影，检测mRNA的相对含量。所有样膜用Actin cDNA探针（Incyte， Emeryville， California， USA.）再杂交，用作内参照。最后进行吸光度扫描，分析杂交信号。 　　2 结果 　　2.1 IGFBP5基因在不同组间的差异 分析正常神经管形成前后的IGFBP5基因表达，发现IGFBP5在神经管形成前后表达显著上