LAMP方法在食源性副溶血性弧菌属检测的应用.docVIP

LAMP方法在食源性副溶血性弧菌属检测的应用 　　【摘 要】目的：探讨副溶血性弧菌属（vibrio parahaemo lyticus， VP）环介导等温扩增（LAMP）在食源性食物检测中的应用价值。方法：利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对12类286份食源性食品标本进行副溶血性弧菌检测；检测结果经统计学分析来评价LAMP法和分离培养法的差异性。结果：LAMP法从64份动物性水产标本中检出44份副溶血性弧菌阳性菌株，阳性率为68.75%，电泳和加荧光染料染色后均能判断结果；国标法从64份动物性水产标本中检出33份副溶血性弧菌阳性菌株，阳性率为51.6%。两种方法的检测结果经统计学分析，P0.005，结果有显著性差异，LAMP法阳性率高于培养法。LAMP法可在24小时内从食品中检测出副溶血性弧菌，而国标法检出副溶血性弧菌需要4-7天，LAMP法更快速。结论：副溶血性弧菌属LAMP法检测阳性率高于国标法，LAMP法可用于食源性食物副溶血性弧菌属的快速检测。 　　【关键词】环介导等温扩增；副溶血性弧菌属；食源性；检测 　　【中图分类号】R155 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0555-02 　　随着生活水平的不断提高，食源性食物的安全越来越受到全社会和政府各级部门的高度重视与关注，而与食源性食物安全相关的微生物检测已成为食品保障的重要措施之一[1]。用LAMP法可以快速、简便、准确的检测出食源性食物中致病性微生物，大大缩短检测时间，提高致病性微生物的检出率，为致病性微生物的分离培养提供指导方向和科学依据。 　　副溶血性弧菌是引起人类急性胃肠炎和食物中毒的一种重要的食源性致病菌，在海水产品中其感染水平可达80%[2]，在细菌性食物中毒中，由副溶血性弧菌引起的居首位[3]。传统的副溶血性弧菌国标法[4]检测时间长，检出率低，不宜快速出结果。 　　环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术[7]是一种新型等温核酸扩增方法，针对靶基因设计4-6条引物，利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件 （60-65 ℃） 保温约 60 分钟，即可完成核酸扩增反应，产物为针对靶基因扩增产生的各种大小的茎环状DNA混合物，副产物为肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀。目前LAMP多侧重于检测方法的建立[8]，用于实际样品检测的研究较少。本实验室参加了国家食品风险安全监测，收集了12类286份食源性食品同时进行副溶血性弧菌国标法和LAMP法的检测对比，探究副溶血性弧菌属LAMP法在食源性食物检测中的实际应用价值，现报道如下： 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 DYY-6C型电泳仪 （北京市六一仪器厂） ；凝胶成像仪 （Gel Doc 2000 BIO-RAD） ；DK-8D 电热恒温水槽 （上海精宏） ； Bst DNA 聚合酶 （Biolabs） ；Betaine （Fluka） ；MgSo4 （Sigma） ；SYBR Green I 、SYBR? Safe DNA Gel Stain （invitrogen） ；dNTP（北京天根公司）；通用型核酸提取试剂盒（广州华瑞安生物）；全自动微生物鉴定生化仪（美国BD）。干燥培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，显色培养基购自法国CHROMagar公司， API生化鉴定卡购自法国生物梅里埃公司，均在有效期内使用。 　　1.2 标本来源 本科室2010年6月至12月收集的12类286份（生禽肉26份；生畜肉26份；熟肉制品32份；速冻熟制米面制品16份；速冻米面制品16份；即食非发酵豆制品26份；动物性水产64；沙拉16份；鲜榨果汁16；生食类蔬菜4份；冰激凌16份；婴幼儿配方食品16份）食源性食物标本；阳性控制菌株：副溶血性弧菌（ATCC-17802）。 　　1.3 食源性食品样品的前增菌 参照国标《食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[4]进行处理。 　　1.4 LAMP检测食源性食品中的副溶血性弧菌 分别取1mL食源性食品标本前增菌液（3%氯化钠碱性蛋白胨水）10000 rpm离心2分钟，弃其上清液后，利用核酸通用提取试剂盒进行核酸提取，再取1μl上清液做待检模板DNA。利用文献[2，6]报道的LAMP检测方法及引物（F3：5- GGCGATATTGGTGTTTATGGGG -3，B3：5- AACGATAAACTGGACCACGG-3，FIP：5- GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG -3，BIP：5- CCGGTGAAATTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGG -3；由上海invitrogen