中药蛇足石杉产石杉碱甲内共生真菌的研究进展.docVIP

中药蛇足石杉产石杉碱甲内共生真菌的研究进展 　　【摘 要】石杉碱甲是来自蛇足石杉的高效、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，野生蛇足石杉频临枯竭，石杉碱甲来源亦将匮乏。来自蛇足石杉的内生真菌可能是解决石杉碱甲资源的有效途径，本文综述了近年产石杉碱甲内生真菌的研究进展。 　　【关键词】蛇足石杉；石杉碱甲；内生真菌 　　【中图分类号】R284 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）11―0089―01 　　石杉碱甲（Huperzine A）是从中药蛇足石杉[Huperzia serrata（Thunb.）Trev.]中提取的一种强效的乙酰胆碱酯酶（actylcholin esterase，AchE）抑制剂[1-2]，是目前临床治疗老年性痴呆症（Alzheimers disease，AD）的最有效药物。因此蛇足石杉遭到疯狂采挖，野生资源频临枯竭。研究显示，植物内生真菌可以产生与植物相同成分的代谢产物[3]，石杉碱甲的资源问题也在此思路下备受研究者的关注。本文综述了近年来中药蛇足石杉产石杉碱甲的内共生真菌的研究进展，旨在为相关研究与应用提供参考。 　　1 石杉碱甲的来源 　　石杉碱甲目前主要从蛇足石杉植株提取获得。蛇足石杉的组织培养尚未取得成功，分离培养来自蛇足石杉的内共生真菌，在解决石杉碱甲的来源方面已显示广阔前景。 　　2 内共生真菌的分离和培养 　　内共生真菌的分离可以用植株的任何部位。方法是先对植株进行彻底的表面灭菌，然后在无菌环境下进行切割培养[4]，一般使用PDA或MS培养基培养，培养过程中可以加入青霉素等抗生素防止细菌污染[5-6]。外植体表面长出菌丝后，挑取不同部位的菌丝，接种到培养基上分离纯化5次以上，保存，进行鉴定分析。 　　3 内共生真菌的形态鉴定 　　分离获得的内共生真菌，培养后观察其菌落、菌丝体和孢子的形态等特征并进行鉴定，参照真菌鉴定手册进行鉴定[7]，目前报道的分自蛇足石杉的共生真菌主要有青霉属、木霉属、镰刀菌属等十几个属[8]。 　　4 内共生真菌的分子生物学鉴定 　　对分离获得的菌株，除进行形态学鉴定，还需进行分子生物学鉴定。方法是先提取真菌基因组DNA，对真菌ITS-rDNA序列扩增，最后测序分析，这主要用于菌种的分类鉴定以及同源性分析和系统进化分析。汪氏等通过ITS-rDNA对从蛇足石杉中分离出127株内生真菌的序列分析进行，结果这些内生真菌分属于Penicillium sp.等19个属[6]。此外可用PAPD、ISSR技术进行多态和聚类分析[9]。 　　5 内共生真菌在蛇足石杉植株的分布 　　内共生真菌在蛇足石杉植株中不同部位的分布不同，张氏等从蛇足石杉的不同部位所分离到的内生真菌的数目是茎部最多，叶次之，根最少[8]，这与本课题组的研究结果及其他学者的研究报道一致[10，6]。 　　6 产石杉碱甲内共生真菌菌株的筛选与含量测定 　　分离得到的内共生真菌能否产石杉碱甲？可通过对其发酵产物的检测分析进行筛选，方法有经典的Ellman法和AChE活性抑制法，刘氏等对Ellman法进行改进，建立了高效、微量、快速的乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选方法[11]。此外，还可用薄层层析、质谱、高效液相、高效毛细管电泳等法对发酵液中石杉碱甲的含量进行测定。 　　7 开发前景广阔的内生真菌菌株 　　杨氏等从蛇足石杉中分离的交链孢霉属真菌YD-01[12]，周氏等分离的内生真菌penicillin chrysogenum Thom SHB[13]，苏氏等分离的子囊菌亚门炭角菌目SY-02菌株[14]等，经过发酵均可产石杉碱甲，产量从8.17μg/L～56.84μg/L，显示出广阔的开发前景。 　　总之，产石杉碱甲内共生真菌研究是热点领域，随着研究的深入，蛇足石杉产石杉碱甲的内生真菌研究必将获得成功，为人类预防和治疗老年性痴呆症发挥巨大作用。 　　参考文献： 　　[1] 蒋亚斌，黄舜韶，黄立安. 石杉碱甲对阿尔茨海默病患者认知功能和行为障碍的改善作用[J].中国综合临床，2002，18（9）：802-803. 　　[2] Wang R，Yan H，Tang XC. Progress in studies of huperzine A，a naturalcholinesterase inhibitor from Chinese herbal medicine[J]. Acta Pharmacol Sin，2006，27（1）：1-26. 　　[3] Stierle A，Strobel G，Stierle D.Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae， an endophytic fungus