反相高效液相色谱法测定尿样中维生素C、B 1 和B 2 的浓度.docVIP

反相高效液相色谱法测定尿样中维生素C、B 1 和B 2 的浓度 　　【关键词】 色谱法 　　水溶性维生素与人体的生长发育和健康有着密切关系，在人体的生命活动中具有十分重要的作用，它们在人体内的含量是衡量一个人的健康指标。目前VitC，VitB 1 和VitB 2 传统测定方法中，VitC常用2，4-二硝基苯肼比色法和2，6-二氯靛酚钠盐滴定，这两个方法灵敏度较低，特异性差，目前一般科研项目都不采用这个滴定法；Vit B 1 和Vit B 2 可用荧光法，但该法前期处理操作繁冗，费时费力，其处理方法和过程增加了影响检测精确度欠佳的人为因素。本文数据采用液相色谱法分离检测。 　　1 实验部分 　　1.1 仪器 SY5000LIQUID CHROMATOGRAPII（BEIFN）具UV/VIS检测器，色谱柱：Lichrosphcr C18，4.6×250，5μm，TL9900色谱数据工作站。 　　1.2 试剂 本实验所用水为石英亚沸蒸馏水，以0.45μm水性微孔滤膜过滤。所用试剂均为分析纯（AR），甲醇为一级色谱纯，标样维生素C、B 1 、B 2 贮备液以0.01mol/L草酸配制，在4℃冰箱中保存。VitC临用新配。流动相A：0.05ml/L KH 2 PO4缓冲液（pH6.00）；流动相B：甲醇。均经0.45μm水性微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用。整个操作应避光，且操作过程要迅速，以防维生素被氧化。 　　1.3 样品处理 检测学生起床后将昨晚尿排空，空腹以200ml水送服VitC500mg，VitB 1 5mg和VitB 2 5mg，然后收集服药后4h内排出的尿于1000ml广口棕色瓶中，并加4%的草酸防护，尿液经0.45μm微孔过滤器过滤 [4] ，超声波脱气后即可上色谱柱分离检测。 　　1.4 色谱仪工作条件 色谱检测的流动相由磷酸二氢钾A和甲醇B组成，其比例为90∶10和65∶35。流速1.0ml/min，柱温：室温，波长：266nm，柱前压：168～240ATM。 　　1.5 标准曲线制作 配制一系列不同浓度的混合液，经检测得出的数据作出如下3种维生素的标准曲线（如图1示）。 　　1.6 色谱检测 分时间段采样，每采一批样有30个左右尿样。样品处理后，按标准样品检测的条件，以外标法检测VitC、VitB 1 和VitB 2 ，经TL9900色谱数据工作站处理检测出的数据和图形。 　　2 检测结果 　　经检测，得出样品中所含3种维生素的量，通过分析可得出如下结果（图2为一个样品的VitC、VitB 1 和VitB 2 3种维生素的色谱分析图）： 　　色谱法检测得此样品中VitC、VitB 1 和VitB 2 的峰高分别为1805mV、40mV和386mV，从标准曲线计算出其4h内排出尿样中的三种维生素的量分别为2.58mg、0.44mg和0.42mg。从五个斑151个尿样检测结果来看，VitC缺乏的占检测总数的15.23%，不足的占13.90%，正常的占70.87%；VitB 1 缺乏的占1.99%，不足的占3.31%，正常的占94.70%；VitB 2 不足的占16.56%，正常的占52.31%，良好的占31.13%（正常以上的占83.44%） [1] 。 　　3 讨论与总结 　　3.1 检测波长的选择 待检测的3种维生素中，VitC在261nm，VitB 1 在246nm，VitB 2 在260nm波长处有最大的吸收 [2，3] ，本次实验曾分别选用以上3种波长检测这三种维生素混合液，以上波长都不是这3种维生素混合液的最大吸收波长，经试验，最后确定266nm波长为三种待检测维生素的最佳检测波长。 　　3.2 回收率 测得人体尿样的3种维生素的含量，再加入已知浓度的标准品，混合后按1.6项操作，测其含量，得出其平均回收率的范围是90.12%～99.85%，变异系数在1.98%～6.56%之间，说明此种方法检测人体尿样中的维生素C、B 1 和B 2 3种水溶性维生素的含量是可靠的。 　　3.3 流动相确定 流动相由磷酸二氢钾缓冲液和甲醇组成，本实验曾以不同比例的流动相和波长对3种维生素C、B 1 、B 2 进行反复分离检测。通过实验，最终摸索出检峰形好，保留时间短的流动相组成比例。在磷酸二氢甲缓冲液∶甲醇=90∶10情况下，VitC保留时间在2.280～2.300min之内，VitB 1 在5.250～5.400min之内，VitB 2 在20min之后。此种情况分析一个的混合样至少需要25min（含平衡时间）。 在流动相比例65∶35的情况下，VitB 1 保留时间9.120～9.310min。中VitC和VitB 1 出峰不好，拖尾严重。本实验曾试行以梯度洗脱法检测，可将3种维生