培养条件对两性霉素B抑制白色念珠菌作用的影响.docVIP

培养条件对两性霉素B抑制白色念珠菌作用的影响 　　【摘要】 目的 综合考察各种因素（不同的培养基、培养基的pH值、真菌接种浓度等）对AmB抑制白色念珠菌作用的影响，为临床合理用药提供理论依据。方法 液体稀释法。结果 在不同的培养基中，AmB对白色念珠菌的MIC值不同，随着pH的增高及真菌接种菌液浓度增加，其MIC值增加。结论 AmB对白色念珠菌的MIC值会受到多种因素的影响，所以，进行药物的抗菌活性研究时应制定并严格执行统一的标准。 　　【关键词】 两性霉素B；白色念珠菌；抑制 　　药物的抗真菌活性受到多种因素的影响，例如，不同的培养基、培养基的pH值、培养时间、培养温度、真菌接种浓度、真菌形态、血清、有氧与厌氧环境等。两性霉素B是目前临床上应用的抗真菌药物，本研究是综合考察各种因素对其抑制白色念珠菌作用的影响，为临床合理用药及进一步药用价值的开发奠定基础。 　　1 实验材料 　　1.1 菌株 白色念珠菌Cla，购于中国医学真菌保藏中心。 　　1.2 药品 两性霉素B（amphotericin B，AmB），上海先锋药业公司，上海第二制药厂生产。AmB溶于蒸馏水中制备成浓度为1280μg/ml的药物原液，过滤除菌。临用时用灭菌蒸馏水稀释为128μg/ml最高浓度药液。 　　1.3 培养基 改良沙氏液体培养基（1%蛋白脉，4%葡萄糖）；YEPD培养基（2%蛋胨，2%葡萄糖，1%酵母浸粉）。 　　1.4 其他 HZQ-X100A型恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司产品）；5000μl、1000μl加样枪（法国GILSON产品）；SN-CS-2D单人净化工作台（苏州净化设备厂）；改良沙堡氏液体培养基（北京奥博星生物技术责任有限公司）。血球计数板、显微镜、滤器（水质滤膜）等。 　　2 实验方法 　　2.1 不同的培养基对MIC值的影响 取活化2次并处于对数生长期的白色念珠菌，用血球计数板计数菌浓度使约为105cfu/ml，以液体稀释法[1]测定改良沙氏液体培养基和YEPD培养基对最低抑菌浓度的影响：（1）2～10管加1ml培养基；（2）1管加1ml药液（128μg/ml），2管加1ml药液（128μg/ml），然后用枪尖吹打混匀，吸取1ml到第3管，依次倍比稀释至第8管后弃去；（3）取上述浓度为105cfu/ml的0.1ml菌液按9→1的顺序加入上述9管中，28℃培养24h，不搅动情况下，以培养基清晰的试管为菌株100%受抑制，此管的药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。 　　2.2 培养基pH值对MIC值的影响 用0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 3～5）和磷酸盐缓冲液（pH 6～8）调整沙氏培养基的pH分别为3、5和8，然后按上述方法测定MIC值。 　　2.3 接种真菌浓度对MIC值的影响 将浓度为102cfu/ml，103cfu/ml，104cfu/ml，105cfu/ml，106cfu/ml的菌液接种于改良沙氏液体培养基，其余步骤与上法同，测定其MIC值。 　　3 结果 　　3.1 不同的培养基对MIC值的影响 AmB在两种培养基中的最低抑菌浓度不同，在改良沙氏液体培养基（pH 5～6）中的MIC为8μg/ml，在YEPD液体培养基（pH 5～6）中的MIC为16μg/ml。 　　3.2 培养基pH对MIC值的影响 结果发现在沙氏培养基中，pH为3时其MIC值为32μg/ml，pH为5时其MIC值为8μg/ml，pH为8时在最高药物浓度的条件下白色念珠菌也能很好的生长。 　　3.3 接种真菌浓度对MIC值的影响结果 见表1。表1 接种真菌浓度对MIC值的影响结果 　　4 讨论 　　培养基的种类及其pH、接种真菌浓度对抗真菌药物在试管内的抗真菌活性影响很大[2]。如氟康唑在低pH时活性可降低1000倍。甚至同一种培养基，由于pH不同，其抗菌活性也不一样[3]。因此，国外在研究抗生素和化学合成药物的抗真菌活性时，对使用的培养基种类及其pH非常重视，常选用不同的培养基和把同一种培养基调整成不同的pH进行研究。国内绝大多数研究者只用沙氏培养基，对培养基的pH也没有进行调整，所以可能影响某些药物的抗真菌效果。pH的不同可能是药物在两种不同培养基中的MIC不同的原因之一。在不同的实验中，实验条件不尽相同，需要接种与积累的菌量不同。所以需考察接种真菌菌液浓度对药物敏感性的影响。如表1所见接种真菌量在102、103、104、105、106cfu/ml时，PLAB对白色念珠菌的MIC分别为2、4、8、8、32μg/ml。随着接种菌量的增加，最低抑菌浓度也增加，这可能与药物需作用于真菌细胞的数量有关，接种菌量的大小直接影响抗真菌药物的抗菌效果。在一般情况下，在一定范围内，接种的菌量越大，药物