大鼠脊髓损伤BBB评分中文版.doc

Western blot 试验操作步骤 蛋白样品制备 1 用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中 2 用4℃预冷的PBS 1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中 3 1000rpm，离心10min 4 倒掉上清，沉淀用1ml PBS 重悬，转入EP管中，再加1ml PBS冲洗离心管壁上残留的细胞转入EP管中 5 4℃，4000rpm，离心5min 6 倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净） 7 配制裂解液，计算所需用量，每个EP管中加入100ul裂解液 (10mg组织/100ul) 若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度100mM，用RIPA稀释至1Mm. 【单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0）2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ; 蒸馏水至 50ml; 混匀后4℃保存】 8 4℃ 裂解30-45min，每5min振荡一次 9 4℃ 14000g 离心5min，取上清（移入1.5ml的EP管中）。 10 蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明） 每管蛋白一致，分装约20ul/管左右（加入5×buffer并用RIPA稀释成1×） 11 将蛋白样100℃，变性5min，，-80℃（or -20℃）保存。 二、SDS的配制： 1 试剂及配制： （1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g，去离子水至100ml，过滤，避光，4℃贮存。 （2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。 （3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）：称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。 （4）10%SDS：1g SDS加入10ml去离子水，室温贮存。 （5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵加入1ml水，4℃保存，现用现配。 （6）TEMED（可购买成品） （7）5×电泳缓冲液(Tank buffer)：称取15.14g Tris碱(分析纯)，72.1g甘氨酸(分析纯)，5g SDS(分析纯)，加适量的超纯水溶解，pH值应该在8.3左右，加超纯水定容1000ml，室温储存。 （8）分离胶、浓缩胶液配方：（两个用小烧杯，用完立即刷） 总体积 5ml 2ml 5ml 浓度 12%分离胶 5%浓缩胶 10%分离胶 水(ml) 1.6 1.4 1.9 30%丙烯酰胺(ml) 2.0 0.33 1.7 1.5mmol/L Tris溶液(pH8.8)(ml) 1.3 — 1.3 1.0mmol/L Tris溶液(pH6.8)(ml) — 0.25 — 10%SDS(ml)（透明） 0.05 0.02 0.05 10%过硫酸铵溶液(ml) 0.05 0.02 0.05 TEMED(ml)（铺胶前加） 0.002 0.002 0.002 2. 制胶程序：（小分子量） 装板（小玻璃朝外） 配制分离胶，加TEMED后，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，从一边开始，并为浓缩胶留足够空间（梳齿长约1cm）。立即覆盖蒸馏水至顶部，天冷可放入烤箱15-20分钟，待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，避免气泡出现。 待聚合后（约20分钟），拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽的前后槽，在加样孔中加入10-20ul样品（蛋白量20ug左右）。左侧第一孔加maker，样品不够可用laoding buffer。电泳：接通电源，浓缩胶80伏约半小时，此后分离胶120/160伏继续1小时左右。 三、转膜： 1、转移缓冲液的配制：（先用先配） 试剂 用量 甘氨酸 14.413g Tris碱 3.0285g 无水甲醇 40-200ml（蛋白量150以上加40） 水 至1000 2、 转膜程序： （1）剪4张滤纸，和一张PVDF膜，大小与凝胶相同（滤纸要比胶小，膜稍大以防转膜时发生短路）。在膜的一角做一记号（或剪角）。 （2）将剪好的膜依次序浸入100%甲醇（10秒）→去离子水（5min）→转移缓冲液（大于10min）。 （3） 滤纸和海绵（纤维）垫浸入转移缓冲液中（大于10min） （4） 剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。 （5） 安装转膜装置：从正极（红色）→负极（黑色）依次为：白色边盒→多孔垫片→（1~2张）滤纸→PVDF膜→凝胶→（1~2张）滤纸→多孔垫片→黑色边盒。扣上吊扣后插进转膜槽中。转膜槽内加冰盒，防止电泳