(荧光探针的光谱性质.docxVIP

绪论1.1前言Aβ1-40是阿尔茨海默病的主要标志物之一，且Aβ单体可以自组装成高度有序的结构，包括二聚体、三聚体、四聚体，或者更大的结构，直至形成纤维。研究表明，Aβ寡聚体具有更强的神经毒性，二聚体和三聚体会破坏神经纤维的弹性，而三聚体和四聚体的毒性是Aβ纤维的二倍。总之，研究表明Aβ早期积聚体可能是疾病诊断的依据之一[1-6]。因此能够及时、简便、有效的检测出Aβ的这种异常的现象，则对于预防和治疗AD既有重要的理论意义又有实际意义。为了检测Aβ的寡聚体，已经发展了抗体和单链抗体技术[7-8]，已报道这些抗体和特征分子形成特异性识别作用[9]。荧光分析法灵敏度高，使用方法简便，而且样品处理简单，具有在溶液中可无损、实时连续检测等优点，因此得到广泛应用[16-21]。本文基于Aβ抗体的研究基础，结合荧光技术，以Aβ的DNA适配体为识别基团，结合荧光分析方法特点，制备荧光探针， 识别Aβ早期积聚体。而探针T-SO508序列(5\to3\)为GCCTGTGGTGTTGGGGCG GGTGCG。本文针对探针T-SO508对Aβ作用及检测进行实验。我们的实验证明，所制备的荧光探针对Aβ1-40具有一定的识别作用，但是由于用于检测的Aβ1-40没有以分子量将其区分，所以识别作用不是特别稳定，下一步准备看能否将Aβ1-40分开，特征检测二聚体和三聚体。2 实验部分2.1 试剂和药品T-SO508（生物工程上海股份有限公司，1 mg，AR）修饰5\JOE,3\TAMRA ，JOE：2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素，是荧光素衍生物的一种，6-JOE更被广泛使用。JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。6-JOE也适合于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=520/548（pH=9.0）。常用于DNA自动测序，标记d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。TAMRA是用于标记蛋白的，全名为羧基四甲基罗丹明，是一种罗丹明类荧光素衍生物，其中6-TAMRA适用于Argon-ion Laser激发光源，常用于荧光标记试剂盒中，且Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0）。探针浓度的配置：加入500 μL（TE缓冲溶液，PH=8.0）浓度为9 μM，作为工作液1；TE缓冲溶液的配制：称取Tris碱6.06 g，加超纯水40 ml溶解，滴加浓Hcl约2.1 ml，调制PH=8.0，定容50 ml成1 M Tris-Hcl；称取9.306 g EDTA-Na2?2H2O，加超纯水35ml，剧烈搅拌，用约1 g NaOH颗粒调至PH=8.0定容至50 ml成0.5 MEDTA；1M Tris-Hcl 1ml,0.2 ml的0.5 M EDTA混合并加超纯水定容至100 ml。三种不同纯度的Aβ1-40（上海强耀生物科技有限公司， 1.0 mg，AR），分别为Aβ1-40纯度90%，Aβ1-40纯度95.65%，Aβ1-40蛋白纯度98%，,用类似的方法将其配制浓度并作为工作液2：若加入溶剂二甲基亚砜0.5 mL则得到462 μM 的Aβ1-40；若加入溶剂二甲基亚砜1 mL则得到231 μM的 Aβ1-40。2.2 仪器设备Agilent Technologies Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer（安捷伦科技有限公司），用于荧光光谱、荧光强度的测定；荧光比色皿，移液枪，5 μL的移液针，1 μL的移液针，用于液体的移取，恒温水浴锅，试管加热器等。2.3 实验操作方法（1）实验分类①将不同含量的Aβ分为三组，第1组为Aβ纯度为90%，向其加入1 mL二甲基亚砜配置成浓度为231 μM作为工作液2，T-SO 508探针中加入500 μL TE(pH=8)配置成浓度为9 μM作为工作液1。荧光测定仪在使用前预热15 min，比色皿要用TE缓冲溶液润洗，操作期间要保持所用仪器的清洁。每次加入试剂之前要用擦镜纸擦拭移液枪、微量进样器等，并多次更换移液头。②第2组为Aβ纯度为95.65%加入0.5mL二甲基亚砜配置成浓度为462 μM的Aβ作为工作液2，T-SO 508探针仍使用第1组中配置好的浓度。仪器及实际操作同上，但唯一不同的是本次实验要控制温度为37，打开白色暗箱使其停留在stand by 状态，同时打开恒温水浴锅，此时要注意检查循环水是否正常流通，待温度达到37℃时才可以开始扫描。（水浴锅上显示的温度不准，以界面上温度控制系统显示的温度为准），每次加入试剂后待温度稳定后再扫描。③第3组为Aβ纯度为98%，加入0.5 mL二甲基亚砜配置成浓度为462 μM的Aβ作为工作液2；T-SO 508仍用第1组配置好的浓度；仪器与试剂操作同第一组。此次实验同样控