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第4讲 细胞融合与体细胞杂交 杂交 不亲和性 不亲和性:在有性生殖过程中,由于生物个体的细胞或组织水平上的不协调而使受精或接合不能正常进行,或是受精后不能产生后代的现象。例如:生殖细胞不能融合,或受精卵不能发育,或子代无繁殖能力等。 是双亲个体间基因型的不协调或是染色体组非同源性在生殖生理表型上的一种反映。不亲和性是稳定物种的重要机理之一。 种间不亲和性:异种、异属生物个体之间的生殖不亲和现象常由染色体组的不同所造成。一般地说,越是远缘则不亲和性越高,直到完全不能受精。 种内不亲和性:种内个体间的不亲和现象往往是受不亲和基因所制约而并不是染色体组不同的结果。 远源杂交 远缘杂交:不同种属之间,或是地理上远缘的种内亚种之间个体的交配称为远缘杂交。 由于种属间存在着种种隔离机制,致使远缘杂交常表现不亲和或获得的远缘杂种表现不育。 体细胞杂交是解决远源杂交不亲和性的有力手段之一,更好地利用自然界基因资源,培育新物种 第一部分 细胞融合 一定义与意义 细胞融合(Cell fusion)是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。 对于植物也叫“原生质体融合”。亲本细胞是体细胞,也叫“体细胞杂交(somatic cellhybridization)”。 由于它不仅能产生同种细胞融合,也能产生种间细胞的融合,因此细胞融合技术在创造新细胞、培育新品种方面意义重大。 二 细胞融合的分类 1.材料:原生质体(去除了细胞壁的裸露的细胞)、动物细胞。 2.从亲本来源: (1)同核体(Homokaryon):基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为。 (2)异核体(Heterokaryon):来自不同基因型的融合细胞。 3.从融合效果: (1)对称融合(Symmetric fusion):两个完整的细胞间的融合。 (2)不对称融合(Asymmetric fusion):利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整细胞进行融合。 三 发展历史 自发融合现象最初在动物细胞中发现。1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。动物体内的破骨细胞也是自发融合形成的多核细胞。 1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。 20世纪70年代初,华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合,开拓了植物细胞融合的研究。 20世纪80年代,齐默曼(Zimmerman)等建立电场诱导细胞融合方法。 主要环节 (1)亲本选择(单细胞或原生质体制备) (2)两原生质体或细胞互相靠近,粘附 (3)质膜融合形成细胞桥 (4)胞质渗透 (5)细胞核融合 (6)融合细胞筛选 原生质体及其制备 (1)定义: 去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体(protoplast)。 (2)特点: 无细胞壁,可以方便地进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。 具有全能性,能再生细胞壁。 (3)制备 (4)分离、鉴定与活力分析 (1)分离 飘浮法:常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。 离心法:低速离心,收集沉淀。 (2)鉴定与活力分析 低渗爆破:爆破后是无形的。渗透压调节剂:葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 染色发法:有活力的原生质体吸收不同染料显示与死亡细胞不同的颜色来分析。FDA(二乙酸荧光素)能自由地穿越细胞质膜,在活细胞内,FDA被酯酶裂解即发荧光(荧光素),由于荧光素不能自由通过质膜,因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。 关键:细胞核的融合 五 细胞融合方法 1.生物法 病毒诱导细胞融合:研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合,同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂,引发细胞质的交流,进而达到细胞融合的目的。 原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似,病毒外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。 仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒(HAJ)是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱,易被灭活而常采用。 缺点:要提前大量培养病毒,并且灭活后才能作为融合剂使用,操作繁琐,而且一旦灭活不充分的话,病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此,目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。 原理与过程 (1)足够量的病毒颗粒附着在细胞膜上起搭桥作用,使细胞聚集在一起。 (2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透,胞质互相融合。粘结部位质膜被破坏,不同细胞间形成通道,细胞质流通并融合(病毒也随之进入细胞质)。 (3)有丝分裂,细胞核融合,形成杂种细胞。 2 化学法 可以采用的化学诱导剂包括:?? NaNO3、高pH的高浓度Ca2+离子、聚
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