肝脏蛋白的提取和浓度测定.2013课件.pptVIP

肝脏蛋白的提取和浓度测定 医学基础实验室 1.肝脏组织的提取 原理： 　　 RIPA裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠（sodium deoxycholate）, 0.1% SDS，得到的蛋白样品可以用于常规的Western。 1.肝脏组织的提取 （1）组织取材：　　 　　取约100mg大鼠肝脏组织，用灭菌的剪刀将组织块尽量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中 1.肝脏组织的提取 （2）超声匀浆：　　 　　加0.5mlRIPA裂解液（含50ulPMSF）,置于冰上，用超声匀浆器进行匀浆,超声每次10秒，重复3次 1.肝脏组织的提取 （3）冰上放置：　　 　　裂解完全后，冰上放置30分钟 1.肝脏组织的提取 （4）4度离心：　　 　　放入离心机中，4℃ 12000rpm离心5min 1.肝脏组织的提取 （5）吸取上清：　　 　　取上清分装于0.2ml离心管中并置于－20℃保存，待用 2.蛋白的浓度测定 2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法 实验内容 ◆肾脏蛋白的提取 ◆蛋白的浓度测定 * * 实验目的 了解并掌握蛋白质的提取方法 了解掌握考马斯亮蓝法（Braford法）测定蛋白质含量的原理和方法 实验内容 实验目的 ◆肝脏组织蛋白的提取 ◆蛋白的浓度测定 操作 步骤 超声匀浆 冰上放置 4度离心 吸取上清 1.肝脏组织的提取 组织取材 超声匀浆 要保持低温 超声强度 以不产生泡沫 为准 注意 事项 考马斯亮蓝法 BCA法 紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。 考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。在595nm下，光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。 * 实验步骤 空白管 标准管 测定管 0 1 2 3 4 5 6 1mg/mL牛血清 白蛋白溶液 蒸馏水 待测样品 考马斯亮蓝G250 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 – – – – – – 1 5 5 5 5 5 5 5 管号 试剂(ml) 1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂: 2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管调零，测定各管吸光度值。 * 以标准液的蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 C（蛋白浓度） A（吸光度） Ax cx 绘制标准曲线： 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/mL OD