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实验二、酵母蔗糖酶的提取和酶活测定 实验目的 学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法； 学习提取生物活性大分子的方法。 实验材料 材料：活性干酵母粉、石英砂； 试剂：95％冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、 5％蔗糖溶液、1N NaOH溶液； 仪器：水浴锅、高速冷冻离心机、722型分光 光度计。 实验原理 蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法； 蛋白质等生物活性大分子的提取方法。（自学） 提取工艺和酶活测定 蔗糖酶 蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下可保持酶活不变；在pH3.0~8.0范围内均可保持较高的酶活； 蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化，或者加入还原剂（如Vc）保持酶活力； 酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大（约270KDa），后者活力较低，分子量约为135KDa，两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶。 提取工艺 1. 破碎酵母细胞的方法： 蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持低温防止酶失活； 或者采用自溶法（适当的酸度和温度下利用酵母菌自身的酶系破坏细胞壁），此方法较为温和，但是时间较长，需加入少量防腐剂，防止过程中外界细菌污染； 化学渗透法等较温和的非机械法。 原则：低温，处理时间短，防止酶失活。 2. 选择性热变性： 根据蔗糖酶的耐热性质，将热不稳定性杂蛋白变性除去， 而蔗糖酶保持活性仍在上清液中；该法简便易行。 原则：1、选择合适的温度和加热时间，防止目的物变性， 2、溶液的蛋白质浓度要合适，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。 3. 有机溶剂沉淀法： 根据蔗糖酶的分子量和亲水性，在溶液中加入一定量的无水乙醇溶 液，利用其脱水作用，破坏了蛋白质分子表面的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下来，而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的 物沉淀的条件。 原则：1、注意在低温下操作，故无水乙醇要预冷； 2、边加乙醇边搅拌溶液，防止局部乙醇过浓，导致酶变性失活； 3、离心后应迅速将上清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，避免酶与有 机溶剂长时间接触，防止其变性。 测定酶活的原理 蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖水解为D－葡萄糖和D－果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂，Mn2+ 是其抑制剂。 葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5－二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。 蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。 ? 提取酶注意事项 了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性，选择合适的提取条件； 提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加一些保护剂（如还原剂、金属螯合剂等）； 提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、强碱等变性的因素； 一般先选择分辨率低处理量大的方法（如萃取、沉淀、吸附）浓缩酶，再采用分辨率高的方法（如离子交换层析、亲和层析、超滤）精制； 通过酶活测定，调节提取条件。 生物活性大分子的提取方法 自学书P36－41 实验步骤 反复冻融法破碎酵母细胞 称取1g活性干酵母泥，0.2g石英砂，置于预冷的研钵中，研磨至粉状，加入5mLPBS（pH7.2），混合均匀，研磨5min ,－20度冷冻，再研磨5min； 离心获得粗酶液 吸取约4mL酵母细胞破碎液于离心管中，8000rpm 5min，保留上清液；——粗酶液 分离纯化获得纯酶液 吸取剩余的约2mL酵母细胞破碎液于离心管中，45度水浴10min，缓慢搅拌，迅速冰浴冷却， 12000rpm 5min，保留上清液；——选择性热变性除去杂蛋白 将上清液置于离心管中，加入等体积预冷的无水乙醇（乙醇终浓度约50％），－20度静置15～20min，12000rpm 5min，保留沉淀物；——有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶 每管加入1mLPBS（pH7.2）于沉淀物中，轻轻搅拌促溶；——纯酶液 酶活测定 蔗糖酶将底物水解为还原糖 试剂 （均35度预热） 粗酶液组 纯酶液组 测定组1 对照组1 测定组2 对照组2 酶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1N NaOH液（mL） － 0.5 － 0.5 5%蔗糖液（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 35度水浴10