1.2基因工程的基本操作程序教学课件（详细）.ppt

类型 步骤 检测内容 方法 结果显示 分子检测 第一步 目的基因是否进入受体细胞 DNA分子杂交 （DNA和DNA之间） 是否成功显示出杂交带 第二步 目的基因是否转录出mRNA 分子杂交技术 （DNA和mRNA之间） 是否成功显示出杂交带 第三步 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 是否成功显示出杂交带 个体水平鉴定 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。 目的基因的表达和检测 归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物） 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 以目的基因转录成的mRNA为模板，在逆转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。 逆转录法（cDNA文库的构建方法） PCR的基本反应步骤 变性 90-95?C 延伸 70-75?C 退火 55-60?C PCR总结： PCR技术扩增与DNA复制的比较 DNA复制 PCR技术 场所 原理 条件 解旋方式 酶 特点 结果 碱基互补配对原则 碱基互补配对原则 四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP 四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化解旋 半保留复制、边解旋边复制 半保留复制、全解旋再复制 体外复制 主要在细胞核内 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等 反转录法 目的基因的信使RNA 目的基因 化学合成法 蛋白质氨基酸序列 mRNA核苷酸序列 基因的核苷酸序列 目的基因 化学合成 推测 推测 单链DNA 合成 3. 人工合成—化学合成法 基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 DNA合成仪 从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 人工合成 归纳：获取目的基因的方法 用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 相同的黏性末端 切口 DNA连接酶 1.过程: 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 质粒 DNA分子(含目的基因） 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 过程: 思考：为什么要构建基因表达载体？ 目的是： （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够表达和发挥作用。 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？ 不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 3.基因表达载体的组成： 它们有什么作用？ a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？ （1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。 ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基