转录水平检测AFP例析.ppt

实验步骤及可能结果 实验原理 实验目的 原理：本制品利用反转录酶PrimeScript RTase将RNA反转录成cDNA，在以cDNA为模板利用TaKaRaEx Taq HS在同一反应管内连续进行RT-PCR扩增反应（利用SYBR GreenI嵌合荧光法）。采用如图所示的One Step RT-PCR方法，反转录以总RNA为模板，利用反应引物合成cDNA，在以此为模板，利用引物进行PCR扩增反应。 01 制品原理 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 应用生物信息学知识, 从基因库中查阅出AFP的DNA和mRNA序列。 根据引物设计原则, 并利用Primer Express 2.0设计软件, 设计出扩增AFP mRNA基因片段的上下游引物和探针。PCR实验成功的最关键环节就是引物的设计。 3 引物、探针的设计和合成 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 用上述提取的的总RNA , 进行逆转录PCR。 反应体系:主要包含上下游引物、各种酶、底物、模板和Mg2+5种物质。现在以TaKaRa One Step SYBR QRT-PCR试剂盒为例作为整个反应体系。 反应条件:针对不同的引物，设定最佳的退火温度是QRT-PCR反应顺利进行的关键。 具体反应程序包括反转录、预变性、变形、退火、延伸等。所有过程的反应温度和作用时间均应经过筛选确定最佳反应条件。具体反应条件的参考值见表1，可在参考值范围内加减选择最佳条件。 根据扩增片断长度, 扩增产物用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳, 在紫外灯下割取特异性的条带, 用QIAquick Gel Extraction Kit(德国Qiagen公司)试剂盒（用于纯化DNA）进行纯化。 4 RT-PCR扩增AFP mRNA 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 用RNase Free dH2O（用于溶解难溶于水的RNA）将总RNA稀释到0.2μg/μl，作为浓度最高的模板（20,1号）。然后取11个容量为150μl的离心管（2~12号），分别加入10μlRNase Free dH2O。从1号管中取10μl加到2号管中，稀释倍数为1。 以此类推，如图所示，将1号主机2倍稀释成，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11，用于标准曲线的制作。 5 标准曲线的制作 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 将倍比稀释的总RNA作为QRT-PCR标准曲线的模板，应用确定的最佳反应条件，进行实时荧光定量PCR扩增，系统根据荧光值的变化规律生成标准动力学曲线、熔解曲线、和标准回归曲线。 5 标准曲线的制作 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 熔解曲线上应该有且只有一个明显的峰，扩增产物的Tm值须非常均一，表明没有产生非特异性扩增产物及引物二聚体。 5 标准曲线的制作 荧光定量RT-PCR应用 5 标准曲线的制作 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 制作出最后的标准曲线之后，就建立了检测AFP表达的方法。 要检测细胞中AFP是否异常表达，即可选取待检测的细胞重复前面的步骤，最后通过电脑得出该细胞RNA的Ct值，在标准曲线上得出它的起始拷贝数，根据此数据来判断是否异常表达。 6 检测细胞AFP是否异常表达 荧光定量RT-PCR应用 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 6 实验出现的可能结果 实验目的 实验原理 实验步骤及可能结果 荧光定量RT-PCR应用 主要包括病原微生物检测、病原体检测、基因病诊断、传染病检测和病变检测等。 分子生物学上RT-PCR应用相当广泛，包括基因转录检测（同一基因在不同组织的表达差异，如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时期的表达差异等。 SNP分析及深入应用。 临床、食品及环境应用 分子生物学应用 遗传学应用 谢 谢 欣 赏 荧光定量RT-PCR 检测AFP mRNA 基因表达方法 01 02 03 04 目录 CONTENT 实验 目的 实验 原理 实验步骤及可能结果 荧光定量RT-PCR应用 实验目的 实验步骤及可能结果 实验原理 原发性肝细胞